CRISPR-Cas基因组编辑技术是人类生命科学史上的革命性和关键性技术,在植物的基础研究和作物遗传改良等方面发挥着重要的作用,但是该技术也存在固有的瓶颈问题即脱靶效应。为了解决CRISPR-Cas基因组编辑技术在植物中脱靶率高的缺陷问题,本研究对目前尚未在植物中验证的、具有低脱靶效应的Sp Cas9蛋白的突变体(evo Cas9、Sniper-Cas9、LZ3 Cas9)在双子叶植物拟南芥中进行验证,并指导突变合成新型的es Cas9、Super Fi-Cas9-1等突变体,创建CRISPR基因组编辑系统,在原生质体细胞和植株中进行靶向编辑,解析各突变体的编辑能力及脱靶效应。首先,选取拟南芥PDS3、FLS2、GL2、TT4、BRI1和FER为靶基因进行靶向编辑,以野生型Seducational mediap Cas9为脱靶阴性对照,Sp Cas9-HF1突变体为低脱靶阳性对照。T7E1和深度测序结果显示:在原生质体细胞和植株中,所验证的突变体均能进行有效的靶向编辑,编辑Wnt-C59纯度形式均与Sp Cas9类似;其中,LZ3 Cas9的靶向编辑效率与Sp Cas9相当,Sp Cas9-HF1、evo Cas9、Sniper-Cas9、es Cas9的编辑效率均有所下降。随后进行脱靶效应检测:首先通过人工设计脱靶guide RNA,模拟进行脱靶编辑,结果显示在多个脱靶guide RNA上,LZ3 Cas9的脱靶编辑效率均低于野生型的Sp Cas9。然后,在编辑阳性植株中检测预测的潜在脱靶位点的脱靶编辑效率,但各突变体编辑的植株上均未能检测到脱靶编辑。随后,在原生质体细胞中,我们选择前期实验中筛选到的可发生脱靶编辑的位点验证这几种突变体,结果显示Sp Cas9-HF1、Sniper-Cas9和LZ3 Cas9的脱靶编辑率均低于Sp Cas9。因此,综合靶向编辑效率的结果表明:Antineoplastic and I抑制剂LZ3 Cas9是一种基因组编辑效率与Sp Cas9相当,且脱靶率低于Sp Cas9的低脱靶基因组编辑工具。随后,我们将LZ3 Cas9突变为LZ3 Sp RY,在低脱靶效应的基础上拓宽其可编辑范围。结果显示,在设计的16种PAM类型(即任意基因组位点)中,在NGG、NGA、NGC、NAG、NAA、NAT、NAC、NTT、NTC、NTG、NCT、NCC、NCA、NCG的14种PAM类型的靶点上均能发生有效编辑,该结果表明LZ3 Sp RY扩展了低脱靶蛋白LZ3 Cas9的可编辑范围。并且,在可检测到的脱靶位点上,LZ3 Sp RY对比Sp RY降低了脱靶效率,保持了LZ3 Cas9低脱靶蛋白的特性。同时,为了进一步解决CRISPR-Cas的脱靶效应问题,我们还创建了Super FiCas9-1新型突变体。在拟南芥原生质体细胞和植株中证明其具有与Sp Cas9相当的靶向编辑能力,进一步的脱靶效应的验证正在继续。