[目 的]随着治疗方Belumosudil溶解度法和药物的增加,皮肤创伤的治疗方法取得了很大的进步,但现有的干预措施仍不能满足当前临床的需要。因此,开发新的促皮肤再生干预策略仍然是当务之急。课题组之前报道了来源于两栖动物的促修复活性肽RL-QN15,具有成为促修复药物的潜力,但仍需进一步深入研究。因此,本研究旨在通过一定的外界手段提升RL-QN15的活性,从而发展基于活性肽RL-QN15的促皮肤创面愈合干预手段,为RL-QN15最终走向临床应用提供一定的研究工作基础。[方 法]通过无乳化剂乳液聚合法合成了空腔聚多巴胺(Hollow Polydopamine,HPDA)纳米粒子,并成功附载了多肽RL-QN15。采用透射电子显微镜、X射线能量色散谱、傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infrared spectroscopy,FTIR)和 X 射线光电子能谱(X-ray Photoelectron Spectroscopy,XPS)等技术表征了 HPDA纳米粒子和附载RL-QN15的HPDA纳米粒子(HPDA nanoparticles loading with RL-QN15,HPDLY2157299AlR)的特性。采用分光光度计测量不同时间点吸光度来评估HPDA对RL-QN15的附载效率以及HPDAlR对RL-QN15的缓释速率。使用CCK8法和钙黄绿素-乙酰氧甲酯/碘化丙啶(Calcein Acetoxymethyl,Calcein-AM/Propidium Iodide,PI)染色法对 HPDA 纳米粒子以及HPDAlR的细胞毒性进行了检测。通过苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,H&E)染色对HPDA和HPDAlR在小鼠体内的毒性进行了评估。通过细胞划痕实验评估了 HPDA 和 HPDAlR 对人永生角化细胞(Human Immortalized Keratinocytes,HaCaT)的促修复活性。通过酶联免疫吸附反应(enzyme-linked immunosorption,ELISA)对小鼠-单核-巨噬细胞白血病细胞(Mouse-Monocyte-Macrophage Leukemia Cells,RAW264.7)释放的细胞因子进行了测定。同时我们也对HPDA、RL-QN15和HPDAlR在小鼠全皮层皮肤损伤创面或烧伤、大鼠口腔溃疡和猪全皮层皮肤损伤创面上的组织再生能力进行评价和比较。通过小动物活体成像对HPDA和HPDAlR在小鼠体内的生物分布和清除率进行了观测。通过浸渍法合成了海藻酸锌水凝胶(Zinc Alginate hydrogel,ZA)和包埋有 HPDAlR 的海藻酸锌水凝胶(Zinc Alginate hydroPhotocatalytic water disinfectiongel embedded with HPDAlR,HPDAlR&ZA)。采用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)、FTIR和XPS等技术表征了水凝胶ZA和HPDAlR&ZA的特性。通过观察不同时间点小鼠体内注射水凝胶ZA和HPDAlR&ZA的图片,对水凝胶体内降解性进行了评估。使用Calcein-AM和H&E染色法对HPDAlR&ZA的体内外毒性进行了检测。通过2,2-联氮基双(3-乙基苯基噻唑啉-6-磺酸)-二胺盐(2,2Azino-Bis(3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid),ABTS)和 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl,DPPH)实验检测了水凝胶 HPDAlR&ZA 的自由基清除活性。通过流式细胞术检测了水凝胶HPDAlR&ZA对人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)产生活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)的影响。通过细胞增殖实验、细胞划痕实验和细胞迁移实验评估了 HPDAlR&ZA的促修复活性。通过ELISA测定了HPDAlR&ZA 对 RAW264.7 释放肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)以及转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)的影响。通过成管实验评估了 HPDAlR&ZA的促血管生成能力。对HPDAlR&ZA在糖尿病小鼠全皮层皮肤损伤创面和糖尿病病人体外皮肤伤口培养模型创面上的组织再生能力进行评价和比较。最后通过免疫荧光和免疫组化等实验手段对HPDAlR&ZA促糖尿病创面愈合机制进行了初步探索。[结 果]第一部分:本文成功制备了 HPDA纳米粒子和HPDAlR纳米复合物。通过HPDA的附载和HPDAlR的缓释作用,RL-QN15不仅可以减少皮肤表面各种酶的降解而且可以维持其有效浓度。HPDA纳米粒子和HPDAlR对HaCaT、RAW264.7和小鼠均无明显毒性,HPDA纳米粒子在体内和体外均无促愈合作用。值得注意的是,HPDAlR显著增强了 RL-QN15加速HaCaT细胞划痕愈合的能力,并选择性地调节RAW264.7细胞释放与愈合相关的细胞因子。更重要的是,与RL-QN15相比,在小鼠皮肤全皮层创伤和大鼠口腔溃疡的动物模型上,HPDAlR的促再生能力分别显著提高了 50倍和10倍。此外,HPDAlR还能提高RL-QN15对小鼠皮肤烫伤和猪全皮肤层损伤创面的愈合效率。第二部分:本文成功制备了 HPDAlR&ZA。HPDAlR&ZA具有清除ROS、ABTS+和DPPH+自由基的能力以及可降解的特性。HPDAlR&ZA对人HaCaT细胞、HUVECs细胞、RAW264.7细胞、人皮肤成纤维细胞(Human Skin Fibroblast,HSF)和小鼠均无明显毒性。HPDAlR&ZA可显著提升RL-QN15和HPDAlR的促进HaCaT细胞、HUVECs细胞和HSF细胞的增殖的能力和HUVECs细胞的迁移和血管生成的能力。HPDAlR&ZA能够调控体外TNF-α和TGF-β1的表达。更重要的是,在糖尿病小鼠皮肤全皮层损伤创伤动物模型以及糖尿病病人体外皮肤伤口培养模型上,HPDAlR&ZA的促修复效果明显强于HPDAlR。此外,通过对两个糖尿病皮肤伤口模型愈合机制的深入探索,发现水凝胶HPDAlR&ZA可通过促MⅠ型巨噬细胞快速极化向MⅡ型巨噬细胞来抵抗炎症反应进而重建血运和增加胶原沉积,快速促进糖尿病创面修复和皮肤再生。[结 论]综上所述,纳米粒子HPDA和水凝胶ZA在体内或外均能明显增强RL-QN15的促再生能力,HPDAlR纳米复合物和HPDAlR&ZA水凝胶在皮肤创面愈合治疗中具有一定的应用潜力。