背景:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是以持续性滑膜增生和进行性关节破坏为主要特征的自身免疫性疾病。滑膜成纤维细胞(Fibroblast-like Synoviocytes,FLSs)是参与RA滑膜炎症的主要靶细胞,其能够分泌多种炎症因子和趋化因子,驱动关节炎症,介导免疫反应。组蛋白乙酰化修饰是发生在组蛋白赖氨酸残基上的可逆的表观遗传学调控方式,通过组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)从多方面调控并参与RA的发病。本课题组前期研究发现人脐带间充质干细胞来源的外泌体(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Derived Exosomes,h UCMSC-Exos)可改善胶原诱导性关节炎(Collagen-Induced Arthritis,CIA)大鼠关节症状,抑制滑膜增生并促进RA FLSs的凋亡,同时还能降低RA FLSs中HDAC1的蛋白表达水平。HDAC可通过调控NF-κselleck NMRB途径调节众多信号分子以及炎症因子,起到抑制炎性细胞及减轻炎症的作用。值得注意的是,FLSs对凋亡信号产生的抵抗性是RA滑膜增生的主要原因,而众多研究已发现HDAC抑制剂(HDAC Inhibitor,HDACi)能抑制NF-κB的激活、诱导癌细胞的凋亡,那么h UCMSC-Exos能否通过影响HDAC/NF-κB途径促进RA FLSs的凋亡仍需进一步实验证明。目的:探讨h UCMSC-Exos对RA FLSs不同亚型HDAC表达水平的影响,阐明h UCMSC-Exos能否通过调控HDAC/NF-κB途径影响RA FLSs凋亡水平及炎性细胞因子的分泌,从表观遗传学组蛋白乙酰化角度为h UCMSC-Exos治疗RA提供理论依据。方法:1.样本制备h UCMSC-Exos的分离和鉴定:收集足月新生儿的脐带组织,组织贴壁法获取原代h UCMSC。培养h UCMSC传代至P3-P7,“饥饿”培养36-48小时,收集上清,采用差速超速离心法获得h UCMSC-Exos,透射电镜观察其形态,纳米颗粒跟踪分析技术测定其粒径,BCA法检测其浓度,免疫印迹法(Western Blot)鉴定其表面分子标志物。2.探究h UCMSC-Exos对RA FLSs中HDAC表达的影响(1)为明确h UCMSC-Exos对RA FLSs中HDAC1-3表达的影响,实验分为两组:RA FLSs组(空白对照组)和h UCMSC-Exos组。检测方法:RT-q PCR检测两组FLSs中HDAC1、HDAC2、HDAC3 m RNA表达水平。(2)为进一步探究h UCMSC和h UCMSC-Exos对RA FLSs中HDAC1影响的差异,实验分为五组:空白对照组、h UCMSC组、h UCMSC-Exos组、曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)组、HDAC1 Inhibitor(Pyroxamide)组。检测方法:(1)RT-q PCR检测h UCMSC-Exos对FLSs中HDAC1 m RNA表达的影响;(2)免疫印迹法(Western Blot)检测h UCMSC-Exos对FLSs中HDAC1蛋白(10197-1-AP)表达的影响。3.基于HDAC1/NF-κB途径探究hUCMSC-Exos对RA FLSs凋亡和分泌促炎细胞因子的影响(1)为明确h UCMSC-Exos通过HDAC1/NF-κB途径对RA FLSs凋亡和分iatrogenic immunosuppression泌促炎细胞因子的影响,实验分为五组:空白对照组、h UCMSC组、h UCMSC-Exos组、曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)组、HDAC1 Inhibitor(Pyroxamide)组。检测方法:(1)流式细胞术检测h UCMSC-Exos对FLSs凋亡的影响;(2)ELISA(酶联免疫吸附)试验检测h UCMSC-Exos对FLSs分泌TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8的影响;(3)免疫印迹法(Western Blot)检测h UCMSC-Exos对FLSs中NF-κB相关蛋白:NF-κB p65(10745-1-AP)、磷酸化-NF-κB p65(Ser 536)(AP0475)表达水平的影响。(2)为进一步验证干预NF-κB能影响h UCMSC-Exos对RA FLSs的调节作用,实验分为四组:空白对照组、NF-κB Inhibitor(吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC))组、h UCMSC-Exos组、PDTC+h UCMSC-Exos共同干预组。检测方法:(1)流式细胞术检测干预NF-κB后h UCMSC-Exos对FLSs凋亡的影响;(2)ELISA(酶联免疫吸附)试验检测干预NF-κB后h UCMSC-Exos对FLSs分泌TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8的影响。4.统计学方法:应用SPSS26.0软件及Graph Pad Prism 8.0绘图软件进行数据统计分析。符合正态分布及方差齐性的计量资料,采用单因素方差分析进行多组间比较,独立样本t检验进行两组间比较,用均数±标准差(X±S)表示;不符合正态分布的计量资料采用Kruskal-Wallis检验,用中位数(四分位数间距)表示。P<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1.样本鉴定h UCMSC-Exos的分离和鉴定:原代脐带组织在培养10-12天时有纺锤形细胞从组织边缘爬出。收集上清,通过超速离心法分离出外泌体,浓度为1.835ug/ul。透射电镜下观察h UCMSC-Exos为茶托状膜性囊泡;纳米颗粒跟踪分析显示h UCMSC-Exos粒径峰值为132nm左右;Western Blot鉴定h UCMSC-Exos表达表面标记物Alix、CD9、CD63,符合外泌体鉴定标准。2.h UCMSC-Exos可抑制RA FLSs中HDAC1的异常表达(1)RA FLSs中HDAC1-3 m RNA的表达:与空白对照组相比,h UCMSC-Exos组HDAC1、HDAC2 m RNA表达水平降低,HDAC3 m RNA表达水平升高。其中HDAC1 m RNA的表达差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)RA FLSs中HDAC1 m RNA的表达:与空白对照组相比,h UCMSC组、h UCMSC-Exos组、TSA组和HDAC1 Inhibitor组HDAC1 m RNA表达水平均降低(P<0.05),且h UCMSC-Exos的作用强于h UCMSC和HDAC1 Inhibitor(P<0.05)。(3)RA FLSs中HDAC1蛋白的表达:与空白对照组相比,h UCMSC组、h UCMSC-Exos组、TSA组和HDAC1 Inhibitor组HDAC1蛋白表达水平均降低(P<0.05),且h UCMSC-Exos对HDAC1的抑制作用较h UCMSC和HDAC1 Inhibitor相比更强(P<0.05)。3.h UCMSC-Exos可通过调控HDAC1/NF-κB途径影响RA FLSs的凋亡和细胞因子的分泌(1)对RA FLSs凋亡的影响:与空白对照组相比,各组RA FLSs凋亡率均升高(P<0.05);与h UCMSC组和HDAC1 Inhibitor组相比,h UCMSC-Exos的促凋亡作用更强(P<0.05)。(2)对RA FLSs分泌促炎细胞因子的影响:与空白对照组相比,各组RA FLSs上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8分泌均降低(P<0.05);h UCMSC-Exos对TNF-α和IL-8分泌的抑制作用强于h UCMSC(P<0.05);h UCMSC-Exos对TNF-α、IL-1β、IL-8分泌的抑制作用强于TSA(P<0.05);h UCMSC-Exos对IL-1β、IL-8分泌的抑制作用强于HDAC1 Inhibitor(P<0.05)。(3)对RA FLSs中NF-κB的影响:与空白Adezmapimod临床试验对照组相比,各组RA FLSs中NF-κB的激活均被显著抑制(P<0.05);h UCMSC-Exos的抑制作用强于h UCMSC和HDAC1 Inhibitor(P<0.05)。(4)干预NF-κB后h UCMSC-Exos对RA FLSs凋亡及分泌促炎细胞因子的影响:与空白对照组相比,PDTC组、h UCMSC-Exos组、PDTC+h UCMSC-Exos共同干预组RA FLSs凋亡率均升高(P<0.05)。h UCMSC-Exos的促凋亡作用强于PDTC(P<0.05)。共同干预后PDTC可逆转h UCMSC-Exos对RA FLSs凋亡的促进作用(P<0.05)。与空白对照组相比,各组RA FLSs上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8分泌均降低(P<0.05),PDTC可逆转h UCMSC-Exos对RA FLSs中IL-8分泌的抑制作用(P<0.05)。结论:h UCMSC-Exos可以模拟母体细胞有效抑制RA FLSs中HDAC1的异常表达;h UCMSC-Exos可能通过抑制HDAC1/NF-κB途径影响RA FLSs的凋亡及促炎细胞因子的分泌。