乳腺癌是女性最常见的恶性CL13900小鼠肿瘤,发病率和死亡率居女性恶性肿瘤之首。三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是一种典型的乳腺癌亚型,无法从传统的靶向治疗中获得临床益处。硒(Selenium,Se)是一种人体必需的微量元素,也是一种具有预防和治疗癌症潜力的微量元素。硒可以诱导癌细胞的凋亡、坏死、自噬等,大量临床前证据表明硒对乳腺癌有抑制作用。铁死亡是一种不同于凋亡、坏死、自噬等的细胞程序性死亡方式,也是近年来重要的研究热点。三阴性乳腺癌中的铁死亡现象已有一些相关研究,但硒是否可以诱导三阴性乳腺癌发生铁死亡及其相关分子机制尚未见报道。本研究以人源三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象,以人源非三阴性乳腺癌细胞MCF-7为对照,用不同浓度亚硒酸钠(Sodium selenite,Na_2SeO_3)进行处理,通过蛋白免疫印迹、免疫荧光、透射电子显微镜、流式细胞术等方法检测铁死亡相关蛋白表达水平、脂质过氧化水平、Fe~(2+)水平、还原性GSH含量、GPx酶活力、铁死亡相关线粒体形态学变化等指标,揭示Na_2SeO_3对铁死亡的影响;同时,借助铁死亡抑制剂DFO和Fer-1进一步验证Na_2SeO_3对铁死亡的影响。已有研究报道,共济失调-毛细血管扩张突变蛋白(Ataxia telangiectasia mutated,ATM)在一些癌细胞的铁死亡过程中发挥潜在调控作用。本实验通过免疫荧光检测Na_2SeO_3对ATM蛋白激活的影响;在此基础上,通过脂质体瞬时转染敲低ATM蛋白或KU55933处理抑制ATM激酶活性后,检测铁死亡相关指标,阐明ATM蛋白在Na_2SeO_3诱导铁死亡中的调控作用,为硒对铁死亡的影响提供新的研究资料。本论文取得以下研究结果:1.Na_2SeO_3诱导人源三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞发生铁死亡。(1)用不同浓度Na_2SeO_3(0、5、6、7、8、9、10μM)处理MDA-MB-231细胞24h后检测细胞活力,所有处理组细胞活力均显著下降(P<0.01)。本研究选择使细胞活力下降至70%、50%、30%左右时的Na_2SeO_3浓度(7、8、9μM)作为后续实验处理浓度。(2)Na_2SeO_3可引起L-ROS阳性细胞比例、MDA含量和Fe~(2+)含量显著升高(P<0.01)。(3)Na_2SeO_3可引起还原性GSH含量和GPx酶活力显著降低c-Met抑制剂(P<0.01)。(4)Na_2SeO_3可导致GPx4和FTH1蛋白表达量显著降低(P<0.01)。(5)Na_2SeO_3处理可导致线粒体的嵴退化甚至消失,线粒体膜密度增大,部分外膜破裂等。以上实验结果初步表明Na_2SeO_3处理诱导MDA-MB-231细胞发生了铁死亡。而用7、8、9μM的Na_2SeO_3处理MCF-7细胞,铁死亡相关指标无显著变化,表明此浓度的Na_2SeO_3不会诱导MCF-7发生铁死亡。同时,本研究用铁死亡抑制剂DFO和Fer-1与Na_2SeO_3共同处理MDA-MB-231细胞(24 h)。实验结果显示,与Na_2SeO_3单独处理组相比,抑制剂联合处理组细胞活力显著升高、MDA含量显著降低、Fe~(2+)含量显著降低、铁死亡相关蛋白GPx4和FTH1蛋白表达量显著升高(P<0.05),进一步表明Na_2SeO_3处理诱导MDA-MB-231细胞发生了铁死亡。2.Na_2SeO_3诱导人源三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞中ATM蛋白激活。免疫荧光实验显示,Na_2SeO_3处理组中胞质区出现p-ATM S1981荧光焦点,荧光强度显著增强(P<0.01),表明Na_2SeO_3激活了ATM蛋白;ATM蛋白激酶抑制剂KU55933(10μM)预处理72 h或si ATM瞬时转染96 h后进行Na_2SeO_3处理(24 h),与Na_2SeO_3单独处理组相比细胞内p-ATM S1981表达量显著下降(P<0.01),表明KU55933预处理72 h和si ATM瞬时转染96 h均能显著抑制Na_2SeO_3诱导的ATM蛋白激活,可用于后续实验研究。3.Na_2SeO_3通过诱导ATM蛋白激活进而诱导MDA-MB-231细胞发生铁死亡。(1)与Na_2SeO_3处理组相比,KU55933预处理或si ATM瞬时转染后与Na_2SeO_3共同处理使得GPx4和FTH1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。(2)KU55933预处理组中死细胞减少、MDA和Fe~(2+)含量显著降低、还原性GSH含量和GPx酶活力显著升高(P<0.05);同样,si ATM瞬时转染组中Fe~(2+)含量显著降低、还原性GSH含量和GPx酶活力显著升高(P<0.05)。以上结果表明抑制ATM蛋白活性减弱了Na_2SeO_3诱导的铁死亡的发生,ATM蛋白在Na_2SeO_3诱导MDA-MB-231细胞铁死亡过程中发挥重要调控作用。综上所述,Na_2SeO_3诱导了人源三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞铁死亡的发生和ATM蛋白的激活。使用ATM抑制剂或Membrane-aerated biofilter脂质体瞬时转染抑制ATM蛋白的激活后抑制了Na_2SeO_3诱导的铁死亡,说明Na_2SeO_3通过诱导ATM蛋白的激活引起MDA-MB-231细胞铁死亡。本论文从铁死亡的角度探讨Na_2SeO_3对三阴性乳腺癌的抑癌机制,为乳腺癌的治疗提供新的视角。