急性肝损伤(GDC-0068溶解度ALI)是指由感染、药物不当使用、缺血等触发因素在短时间内诱导发生的肝细胞损伤。由于发生机制复杂,预防与治疗方面还面临着诸多挑战,亟需揭示急性药物性肝损伤机制。CCl_4具有亲肝的生物学特性,且CCl_4通过诱导急性肝损伤炎症反应在机制和症状上更接近人类急性药物性肝损伤,因此,CCl_4诱导的急性肝损伤动物模型常常被用在阐释人类ALI的发病机制研究中。目前为止,已经发现氧化应激、炎症反应、坏死及凋亡等与ALI的发生密切相关。目前,有实验结果显示轻度炎症和应激反应可能与保护细胞稳态有关,但它们之间的关系是不十分清楚。目前认为,当外部刺激诱导应激反应时,如果应激反应不足以防御体内平衡,则诱导炎症反应。而细胞核与内质网、线粒体是炎症的关键调控细胞器,转录组学等实验发现内质网、线粒体等应激反应通过选择性翻译即上调促修复蛋白和/或抑制促损伤蛋白的表达从而发挥抗损伤作用。IL-33作为免疫系统的“警报器”,能够迅速触发免疫系统对病毒入侵和肝脏毒性损伤作出反应。已有实验发现,IL-33可以缓解高脂肪饮食(HFD)诱导的肝脂肪变性和胰岛素抵抗,当肝慢性损伤时,IL-33通过激活Th2反应和肝星状细胞促进了肝纤维化的形成,认为依据机体免疫环境的不同,IL-33/ST2轴通过不同途径激活细胞应激反应,从而发挥保护性作用。IL-33过表达鼠也表现出轻度炎症反应、肝纤维化等变化,表明IL-33过表达鼠是阐明机体炎症状态对肝脏损伤影响的一个良好的动物模型。二甲双胍作为糖尿病的一线用药具有抑制线粒体呼吸链复合体I的功能,有报道显示利用鱼滕酮抑制线粒体呼吸链复合体I能够有效减轻CCl_4诱导的ALI。最近研究发现二甲双胍通过抗炎、抗应激及免疫调控等多种基本病理发挥着预防或治疗多种疾病的作用,提示利用二甲双胍的membrane photobioreactor作用特性能够为阐明应激反应与炎症在CCl_4诱导的急性肝损伤动物模型中的作用及其机制。因此,本实验分别以野生型和IL-33基因过表达小鼠CCl_4急性肝损伤模型为研究对象,结合血清生化指标、形态学观察、转录组学分析,以线粒体、内质网等细胞器应激反应为切入点,进一步阐释二甲双胍拮抗急性炎症反应诱导肝损伤的机制。方法:1.通过对野生型和IL-33基因过表达小鼠腹腔注射CCl_4构建小鼠ALI模型,具体分组如下:野生型小鼠分组包括对照组(WT-Na Cl)、橄榄油组(WT-Oil)、模型组(WT-CCl_4)、二甲双胍组(WT-Met)、二甲双胍预治疗组(WT-CCl_4+Met);IL-33基因过表达小鼠分组包括对照组(IL33-Na Cl)、橄榄油组(IL33-Oil)、模型组(IL33-CCl_4)、二甲双胍组(IL33-Met)、二甲双胍预治疗组(IL33-PF-6463922CCl_4+Met)。2.应用AST/ALT酶活性检测试剂盒及HE染色评估野生型和IL-33基因过表达小鼠急性肝损伤模型是否构建成功,及二甲双胍预治疗对野生型和IL-33基因过表达模型组小鼠肝损伤的影响。3.取野生型和IL-33基因过表达小鼠各个实验组小鼠肝组织,Trizol裂解后提取RNA,通过转录组学分析各实验组基因表达情况;以WT-Na Cl组为对照,分析WT-CCl_4组和WT-CCl_4+Met组小鼠肝组织基因表达变化;以IL33-Na Cl组为对照,分析IL33-CCl_4组和IL33-CCl_4+Met组小鼠肝组织基因表达变化,通过GO富集分析和KEGG信号通路富集分析明确差异表达基因的生物学功能。4.通过Venn图分析二甲双胍预治疗对野生型和IL-33基因过表达小鼠CCl_4急性肝损伤模型肝组织基因表达的影响,通过GO富集分析和KEGG信号通路富集分析WT-CCl_4+Met组和IL33-CCl_4+Met组小鼠肝组织表达恢复基因的生物学功能。5.取野生型和IL-33基因过表达小鼠各个实验组肝脏组织,Trizol裂解后提取RNA,逆转录为c DNA后,通过q PCR方法检测线粒体呼吸链复合体亚基和抗氧化基因的表达变化。6.取野生型和IL-33基因过表达小鼠各个实验组肝脏组织,RIPA裂解后提取蛋白,通过Western Blot方法检测线粒体呼吸链复合体亚基、抗氧化蛋白和内质网应激相关蛋白的表达变化。结果:1.从HE染色、肝功能酶等的变化,我们发现1)WT-CCl_4组和IL33-CCl_4组小鼠血清AST/ALT水平均急剧升高,HE染色肝细胞排列紊乱,肝小叶界限模糊,肝索结构破坏,大量炎性细胞浸润。与WT-CCl_4组相比,未见IL33-CCl_4组小鼠急性肝损伤主要指标的变化。2)WT-CCl_4+Met组和IL33-CCl_4+Met组小鼠血清AST/ALT水平均明显下降,肝细胞排列规则,肝小叶界限明显清晰,肝索结构破坏减少,炎性细胞浸润数量下降。3)与WT-CCl_4+Met组相比,IL33-CCl_4+Met组小鼠血清AST/ALT水平降低更明显和肝脏组织学损伤程度明显降低。2.通过转录组学分析差异表达基因我们发现:1)在野生型小鼠中:与WT-Na Cl组比较,WT-CCl_4组共有935个基因表达上调,914个基因表达下调;与WT-Na Cl组比较,WT-CCl_4+Met组共有344个基因表达上调,509个基因表达下调。2)在IL-33基因过表达小鼠中:与IL33-Na Cl组比较,IL33-CCl_4组共有1025个基因表达上调,706个基因表达下调。与IL33-Na Cl组比较,IL33-CCl_4+Met组共有320个基因表达上调,310个基因表达下调。提示二甲双胍通过稳定基因表达减轻CCl_4诱导的急性肝损伤。3.通过KEGG信号通路富集分析,我们发现:1)与WT-Na Cl组和IL33-Na Cl组比较,WT-CCl_4组和IL33-CCl_4组差异表达基因功能相似,表达下调的基因主要富集在甾体类激素合成、细胞色素P450对外来物质、细胞色素P450对药物的代谢和氨基酸合成等相关通路;而表达上调的基因主要富集在细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路等炎症等相关信号通路。4.通过Venn图分析发现:WT-CCl_4+Met组小鼠肝组织有1428个差异表达基因表达恢复,IL33-CCl_4+Met组小鼠肝组织有1415个差异表达基因表达恢复;进一步通过KEGG信号通路分析上述表达恢复基因的功能:WT-CCl_4+Met组和IL33-CCl_4+Met组代谢相关基因主要富集在甾体类激素生物合成、P450酶对外源物质代谢、P450酶对药物代谢以及氨基酸的合成和降解等线粒体功能相关信号通路;炎症相关基因主要富集在细胞因子受体相互作用;而IL33-CCl_4+Met组小鼠肝组织中表达下调的基因还富集在趋化因子信号通路、肿瘤坏死因子信号通路和NF-k B信号通路等炎症相关信号通路,二甲双胍在IL-33基因过表达鼠中抗炎作用明显优于野生型小鼠。5.通过检测线粒体呼吸链复合体m RNA及相关蛋白水平变化,我们发现:1)与WT-Na Cl组和IL33-Na Cl组比较,WT-CCl_4组和IL33-CCl_4组线粒体呼吸链复合体MT-ND1、NDUFV1、MT-ATP6以及ATP5A1的m RNA均明显下降,同时线粒体呼吸链复合体亚基MT-ND1及NDUFA9蛋白表达量下降。2)与WT-CCl_4组和IL33-CCl_4组比较,WT-CCl_4+Met组和IL33-CCl_4+Met组小鼠肝组织线粒体呼吸链复合体m RNA表达有所升高,线粒体呼吸链复合体亚基蛋白表达趋势与m RNA一致。3)与野生型小鼠比较,在IL-33基因过表达小鼠中,IL33-CCl_4+Met组线粒体呼吸链复合体m RNA的表达以及呼吸链亚基蛋白表达量增加的更明显,线粒体呼吸链复合体亚基的表达更趋于正常水平。6.通过检测抗氧化蛋白SOD2的m RNA表达量和蛋白表达水平变化,我们发现:1)与WT-Na Cl组和IL33-Na Cl组比较,WT-CCl_4组和IL33-CCl_4组小鼠肝组织抗氧化蛋白SOD2的m RNA和蛋白表达量有所降低。2)与WT-CCl_4组和IL33-CCl_4组比较,WT-CCl_4+Met组和IL33-CCl_4+Met组小鼠肝组织抗氧化蛋白SOD2的m RNA和蛋白表达量有所升高。3)与野生型小鼠比较,在IL-33过表达小鼠中,IL33-CCl_4+Met组抗氧化蛋白SOD2的m RNA和蛋白表达量升高的更明显,使肝细胞更趋于氧化还原稳态。7.通过检测内质网应激相关蛋白p-e IF2α和Bip蛋白表达量变化,我们发现:1)与WT-Na Cl组和IL33-Na Cl组比较,WT-CCl_4组和IL33-CCl_4组小鼠肝组织中p-e IF2α及Bip蛋白表达量均显著升高。2)与WT-CCl_4组比较,WT-CCl_4+Met组小鼠肝组织中p-e IF2α及Bip蛋白表达量未发生明显改变;与IL33-CCl_4组比较,IL33-CCl_4+Met组小鼠肝组织中p-e IF2α及Bip蛋白表达量显著降低。3)与野生型小鼠比较,在IL-33过表达小鼠中,IL33-CCl_4+Met组p-e IF2α及Bip蛋白表达量降低的更明显,能够更显著的抑制CCl_4诱导的内质网应激反应。结论:1、二甲双胍预治疗CCl_4急性肝损伤模型小鼠尤其是IL-33基因过表达小鼠肝病理变化与生化指标明显改善,表明二甲双胍的抗CCl_4诱导肝损伤作用可能与IL-33基因过表达小鼠相关性炎症反应等变化有关。2、二甲双胍通过提高野生型小鼠与IL-33基因过表达小鼠线粒体呼吸链复合体表达,表明二甲双胍通过抑制CCl_4导致的线粒体功能障碍从而减轻肝损伤。3、二甲双胍能够降低IL-33基因过表达小鼠急性肝损伤动物模型肝组织内质网应激相关蛋白的表达,表明二甲双胍抑制肝细胞内质网应激损伤性反应是减轻肝损伤作用机制之一。4、综合分析趋化因子、肿瘤坏死因子、氧化应激等炎症与应激反应相关信号通路转录组学实验结果,表明二甲双胍可能在细胞核与线粒体/内质网层面,通过提高氧化还原稳态等细胞应激抵抗能力,降低炎症因子表达等综合机制减轻了CCl_4诱导的肝损伤。