研究表明,NOD样受体家族吡啶结构域3(NOD-like receptor protein family pyrin domain containing 3,NLRP3)介导的细胞焦亡是参与癫痫发展的信号通路,沉默信息调节因子1(Silent information regulator 1,SIRT1)的激活可以抑制NLRP3炎性小体的表达。文献显示二氢杨梅素(Dihydromyricetin,DHM)在神经系统疾病中具有神经保护作用,但其在癫痫和共患病认知障碍中的影响及机制尚不清楚。本研究旨在探讨DHM是否可以通过调节SIRT1和NLRP3炎性小体来减轻匹罗卡品诱导的癫痫大鼠的海马神经元损伤和学习记忆障碍。应用匹罗卡品建立大鼠癫痫模型,观察DHM对癫痫的影响。观察大鼠癫痫自发作频率、发作持续时间及脑电图间期棘波放电。采用尼氏染色法评价海马锥体神经元的损伤。采用Western blotting、免疫组化、实时逆转录聚合酶链反应、酶联免疫吸附法检测海马组织中SIRT1和NLRP3、caspase-1、GSDMD等因子的变化。认知功能通过观察海马突触超微结构、Morris水迷宫测试、海马CA1区在体长时程增强(Long term potentiation,LTP)记录和海马相关突触蛋白的表达进行验证。实验数据显示,DHM诱导SIRT1表达上调和NLRP3、caspase-1、GSDMD表ICI 46474 NMR达下调,从而对癫痫大鼠产生神经保护作用。此外,DHM还能通过减少海马神经元和突触可塑性的损伤改善认知功能。与此同时,在癫痫患者的病理组织切片和血清中,观察了NLRP3炎性小体相关因子和SIRT1的表达以及它们的相关性。总之,本研究首次证明DHM可能通过抑制细胞焦亡和神经炎症在癫痫和认知障碍合并症的治疗中发挥作用。本研究由以下三部分组成。第一部分 二氢杨梅素对匹罗卡品诱导的大鼠癫痫发作和认知功能的影响目的:建立匹罗卡品癫痫模型,观察DHM处理后对于大鼠癫痫慢性期自发作和认知功能的影响,通过视频监控和脑电图分析、行为学观察、突触蛋白的表达等评估DHM的抗癫痫和改善认知的作用。方法:将6-8周的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为4组:正常对照组(Control组),匹罗卡品组(Pilo组)、匹Female dromedary罗卡品+二氢杨梅素50mg/kg/d组(Pilo+DHM 50 mg/kg/d组)和匹罗卡品+二氢杨梅素100mg/kg/d组(Pilo+DHM 100 mg/kg/d组),每组12只。Pilo组及Pilo+DHM组采用腹腔注射氯化锂-匹罗卡品的方法诱导大鼠癫痫持续状态(status epilepticus,SE),Control组同时给予0.9%无菌生理盐水腹腔注射。Pilo+DHM组在SE后第3天开始腹腔注射DHM,对照组和Pilo组注射同等剂量的生理盐水,每天一次,连续给药28 d。大鼠SE后第5周,每组随机选取6只大鼠植入电极,在第6-7周进行视频监测并记录大鼠SRS发作及发作期和发作间期的脑电图;在SE后的第8周,每组选取8只大鼠进行Morris水迷宫实验;每组选取6只进行在体场电位记录;每组3只通过Western blot检测突触蛋白的表达。结果:selleck化学1.脑电图:与癫痫大鼠相比,经DHM干预的大鼠脑电间期放电次数均明显减少。2.视频监控:DHM干预后,大鼠SRS发生频率和持续时间显著降低,对癫痫发作有一定的抑制作用。3.水迷宫:可视平台实验中各组大鼠到达平台的时间和平均游泳速度没有差异。在定位航行实验中,从试验第3天开始,与Control组相比,Pilo组大鼠的逃避潜伏期明显延长。与Pilo组相比,Pilo+DHM组的逃避潜伏期明显缩短。空间探索实验显示,Pilo组大鼠穿越平台的次数和在原平台象限的停留时间明显少于Control组。与Pilo组相比,Pilo+DHM组大鼠穿越平台的次数和原平台象限的停留时间显著增加。4.在体场电位记录:癫痫发作对大鼠LTP效应有明显抑制作用,DHM干预部分逆转了癫痫发作引起的LTP抑制,显示DHM能够在一定程度上减轻突触可塑性的损伤。5.突触蛋白的表达:癫痫大鼠海马中PSD95和synaptophysin的表达水平明显减少,而DHM干预后,大鼠海马中相关蛋白的表达显著升高。结论:DHM可通过抑制癫痫大鼠SRS和发作间期放电、提高PSD95和synaptophysin的表达,从而改善癫痫大鼠学习记忆能力和突触可塑性。第二部分 二氢杨梅素对匹罗卡品诱导的癫痫大鼠神经保护作用的机制探讨目的:探讨DHM干预匹罗卡品诱导的癫痫大鼠后,与NLRP3相关的细胞焦亡通路的变化方法:将6-8周的雄性SD大鼠随机分为4组:正常对照组(Control组),匹罗卡品组(Pilo组)、匹罗卡品+二氢杨梅素50mg/kg/d组(Pilo+DHM 50mg/kg/d组)和匹罗卡品+二氢杨梅素100mg/kg/d组(Pilo+DHM 100mg/kg/d组),每组10只。Pilo组及Pilo+DHM组采用腹腔注射氯化锂-匹罗卡品的方法诱导大鼠SE,Control组同时给予0.9%无菌生理盐水腹腔注射。Pilo+DHM组在SE后第3天开始腹腔注射DHM,对照组和Pilo组注射同等剂量的生理盐水,每天一次,连续给药28 d。每组选取3只进行石蜡切片的制备,用于尼氏染色和免疫组织化学染色,分别观察大鼠海马神经元的损伤情况和NLRP3、GSDMD、caspase-1的表达水平;每组随机选取3只大鼠观察海马突触超微结构;每组随机选取3只进行荧光定量PCR检测,评估大鼠海马中NLRP3、GSDMD、caspase-1和SIRT1等指标的m RNA表达水平;每组3只通过Western blot检测大鼠海马中NLRP3、GSDMD、caspase-1的蛋白表达水平;每组选取6只进行ELISA实验,检测IL-β和IL-18的表达水平。结果:1.尼氏染色:与Control组相比,Pilo组大鼠海马神经元细胞形态异常,神经元存活数量明显减少;DHM干预后,与Pilo组相比,细胞形态接近正常,神经元存活数量明显增多,显示DHM可以减少海马神经元损伤。2.海马CA1区突触超微结构:与Control组相比,Pilo组大鼠海马CA1区突触间隙明显增大,DHM干预后大鼠海马CA1区突出间隙较Pilo组显著减少;同时,Pilo组大鼠海马CA1区突触后致密物厚度较Control组明显减少,与Pilo组相比,Pilo+DHM组的大鼠海马CA1区突出后致密物厚度显著增加。3.免疫组化:海马CA3区免疫组化染色显示,癫痫大鼠的NLRP3、GSDMD、caspase-1的免疫阳性表达高于正常大鼠,而DHM干预能够部分降低这些蛋白在海马的表达。GSDMD在海马CA1区蛋白的表达,与Control组相比,Pilo组明显减少,而Pilo+DHM组较Pilo组明显增加。4.荧光定量PCR:与Control组相比,Pilo组大鼠海马中NLRP3、GSDMD和caspase-1的m RNA表达水平明显升高;DHM干预后,大鼠的海马中相关因子的表达水平较Pilo组均明显降低,结果显示DHM在转录水平上对NLRP3炎性小体相关通路有一定的抑制作用。5.NLRP3通路相关蛋白的表达:与Control组相比,Pilo组大鼠海马区NLRP3、GSDMD-N(GSDMD的裂解形式)、cleaved-caspase-1蛋白的水平显著增多,DHM干预后,癫痫大鼠海马组织中焦亡相关蛋白的表达水平较Pilo组明显降低。6.Il-1β和IL-18炎症因子的表达:DHM干预可下调匹罗卡品诱导癫痫大鼠海马中IL-1β和IL-18的表达。7.SIRT1的表达:PCR结果显示,与Control组相比,Pilo组大鼠海马中SIRT1 m RNA表达水平明显降低,DHM干预后,上调了SIRT1 m RNA在海马的表达水平;Western blotting结果显示癫痫显著降低了SIRT1蛋白的表达,而DHM可提高SIRT1的表达。结论:DHM的干预能够减少癫痫大鼠海马神经元的损伤及突触结果的异常,这可能是通过SIRT1/NLRP3通路介导的细胞焦亡实现的。第三部分 癫痫患者NLRP3炎性小体和SIRT1表达及相关性的探讨目的:分析NLRP3介导的细胞焦亡和SIRT1信号通路在癫痫患者中的变化,为寻找新的治疗靶点提供理论依据。方法:组织病理学切片评估:收集经手术治疗的耐药性癫痫患者的组织病理学切片为癫痫组(9例)和海绵状血管瘤患者的组织病理学切片(8例),共17例,进行免疫组织化学染色,检测NLRP3、caspase-1、IL-1β和SIRT1蛋白的表达。血清评估:收集门诊癫痫患者的血清样本作为癫痫组(45例),同期体检中心的健康人的血清样本作为对照组(38例),共83例;通过ELISA观察血清中NLRP3、caspase-1、IL-1β和SIRT1的表达水平。结果:1.病理组织学评估:与Control组相比,耐药性癫痫患者大脑皮层组织中的NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达增多,而SIRT1的表达水平有所下降;并且SIRT1与NLRP3炎性小体的表达具有相关性。2.血清评估:与Control组相比,耐药性癫痫患者血清中IL-1β的浓度升高;与单侧海马硬化的耐药性癫痫患者相比,双侧海马硬化的患者血清中caspase-1的表达水平明显升高。结论:NLRP3炎性小体通路在癫痫患者体内的表达明显增多,并且与SIRT1的表达存在部分相关性;caspase-1在外周的表达水平与耐药性癫痫患者的海马硬化可能有关。