目的:小肠旷置术(small intestinal bypass,SIB)在改善糖耐量和胰岛素敏感性的同时,具有较好的降脂效果;同时我们还发现胆汁酸(Bile acids,BA)水平的升高与糖代谢改善密切相关。然而SIB是如何通过BA代谢来调控血糖的机制尚不十分清楚。结合前期的研究结果,我们推测:SIB术后肠道菌群的改变与BA代谢相互作用,调控糖尿病(Diabetes mellitus,DM)大鼠肝脏糖异生,进而改善糖代谢。本研究选择链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)-诱导的糖尿病(STZ-DM)大鼠为研究对象,以中段小肠旷置术(Middle small intestinal bypass,MSIB)为手术模型开展实验,明确MSIB术后肠道菌群调节BA代谢的作用,阐明BA抑制肝脏糖异生的关键机制。为DM的临床治疗提供新的思路和策略。方法:选择4-6周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重180-220g,采用STZ(60mg/Kg)一次性腹腔注射法建立糖尿病大鼠模型,3天后选取成模大鼠(随机血糖>16.7mmol/L)作为进一步实验对象。将成模STZ-DM大鼠随机分成两组,每组8只,分别进行MSIB和Sham(假手术组)。分别在术前和术后1、2、3、4、5、6周,测量大鼠的体重(Body weight,BW)、进食量(Food Intake)、空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG);于术前、术后第2和第6周分别行口服葡萄糖耐量试验(Oral glucose tolerance test,OGTT)和胰岛素耐量试验(Insulin tolerance test,ITT)。于术后第6周将大鼠处死,从大鼠门静脉取血,测定血脂及总胆汁酸(Total bile acids,TBA)水平;采用酶联免疫吸附(Enzyme linked immune-sorbent assay,ELISA)法测定血清中胰岛素(Insulin)、胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)、肽YY(Peptide YY,PYY)、瘦素(Leptin)、饥饿素(Ghrelin)以及成纤维细胞生长因子21(FGF-21)等激素水平;搜集肝脏标本,采用高碘酸希夫氏(Periodic acid-Schiffs,PAS)染色法检测肝糖原,通过光密度分析测定糖原含量,采用q PCR测定肝脏组织中糖异生关键酶及转录因子的基因表达;搜集粪便标本,利用16s r RNA测序分析大鼠粪便中肠道菌群;采用靶向代谢组学测定大鼠粪便中BA成分及含量;搜集回肠组织,采用蛋白质印迹法(Western blot,WB)测定末端回肠中胆汁酸代谢相关蛋白(法尼酯衍生物X受体(Farnesoid X receptor,FXR)和G蛋白偶联受体5(Takeda G protein-coupled receptor 5,TGR5))表达水平。结果:1、两组大鼠存活率:MSIB组大鼠在术后第1周死亡1只,Sham组大鼠在术后第2、5周各死亡1只,其余大鼠均存活至实验结束。2、体重、进食量和FBG水平:MSIB组术前体重和进食量较Sham组无统计学差异(P>0.05)。MSIB组术后1至2周体重均低于Sham组(P<0.05),而术后3至6周两组间大鼠体重无统计学差异(P>0.05)。术后1至6周,MSIB组进食量低于Sham组(P<0.05),FBG水平均明显低于Sham组(P<0.01)。3、OGTT:术前MSIB组和Sham组无统计学差异(P>0.05)。术后第2周和第6周,MSIB组大鼠葡萄糖耐量均较Sham组大鼠明显改善,表现为OGTT中峰值血糖(30min或者60min)较Sham组明显降低(P<0.01);另外,术后第2和6周,MSIB组AUC_(OGTT)均明显低于Sham组(P<0.001)。4、ITT:术后第2周,腹腔注射胰岛素后MSIB组大鼠血糖下降速率在45min时高于Sham组(P<0.05);术后第6周,腹腔注射胰岛素后MSIB组大鼠血糖下降速率在60min时高于Sham组(P<0.05);术后第2周,MSIB组大鼠AUC_(ITT)低于Sham组(P<0.05),而术后第6周两组AUC_(ITT)无统计学差异(P>0.05)。5、血清总胆汁酸、血脂水平变化:术后6周,MSIB组大鼠血清空腹TBA水平高于Sham组大鼠(P<0.05)。MSIB组大鼠空腹血清的TG、CHOL、HDL、LDL、NHDL和FFA水平均低于Sham组(P<0.05)。6、血清激素水平变化:术后6周,MSIB组空腹血清Insulin和Leptin水平高于Sham组(P<0.05),MSIB组大鼠血清Ghrelin水平低于Sham组(P<0.05),两组大鼠血清GLP-1、PYY、FGF-21水平无统计学差异(P>0.05)。7、肝糖原含量:术后6周,镜下观察两组肝脏PAS染色,两组肝脏组织结构清晰,MSIB组糖原颗粒丰富,呈紫色,糖原颗粒保持较好的原位状态,Sham组肝细胞内有较多空泡,糖原流失较多,颜色淡染。MSIB组糖原光密度值明显高于Sham组(P<0.05)。8、荧光定量PCR:术后第6周,MSIB组大鼠肝脏糖异生关键酶PCK1、G6PC基因m RNA相对表达量水平较Sham组显著降低(P<0.01);MSIB组大鼠肝脏组织中转录因子FOXO1、PGC-1α水平较Sham组降低(P<0.05);CREB水平两组间无统计学差异(P>0.05)。9、粪便中肠道菌群变化:术后6周,搜集两组大鼠粪便,采用16s r RNA测序分析大鼠粪便中肠道菌群。MSIB术后STZ-DM大鼠肠道菌群发生了显著变化,MSIB组菌群多样性较Sham组升高(P<0.05)。在属的水平上,MSIB组中拟杆菌(Bacteroides)、梭状杆菌(Clostridium)、大肠杆菌(Eschmaternally-acquired immunityerichia)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、志贺氏菌(Shigella)丰度均较Sham组升高(PCompound 3<0.05)。10、粪便中胆汁酸成分变化:术后6周,搜集两组大鼠粪便,采用GC/MS法测定粪便中各胆汁酸含量成分。TBA水平:MSIB组较Sham组升高(P<0.05)。初级胆汁酸水平:甘氨胆酸(GCA)、牛磺胆酸(TCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)水平MSIB组较Sham组下降(P<0.05),鹅去氧胆酸(CDCA)水平MSIB组较Sham组升高(P<0.05)。次级胆汁酸水平:MSIB组大鼠粪便组织中脱氧胆酸(DCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、石胆酸(LCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、熊selleck NMR去氧胆酸(UDCA)水平较Sham组均升高(P<0.05)。11、相关性分析:MSIB术后大鼠粪便中梭状杆菌Clostridium丰度与血清总胆汁酸TBA含量呈显著正相关,与粪便中LCA和GLCA含量显著正相关,与大鼠进食量、FBG、OGTT和PCK1表达负相关。粪便中次级胆汁酸含量与大鼠进食量、FBG、OGTT和PCK1、G6PC表达负相关。12、回肠中FXR和TGR5水平变化:术后6周,收集两组大鼠回肠组织,采用WB法测定末端回肠中FXR和TGR5蛋白表达水平。MSIB组末端回肠中FXR和TGR5蛋白表达水平均高于Sham组(P<0.05)。结论:1、MSIB可以降低肝脏糖异生酶PCK1和G6PC的表达;2、MSIB术后梭菌Clostridium丰度升高与血糖下降密切相关;3、MSIB通过升高次级胆汁酸(LCA和GLCA),抑制肝脏糖异生改善血糖。