肺癌是死亡率最高的肿瘤类型之一,尽管随着分子靶向药物和免疫治疗的应用,肺癌的死亡率已经得到了有效控制,但长期用药引起的获得性耐药仍然是肺癌治疗的障碍,因此寻找新型有效的药物对肺癌治疗至关重要。凋亡(Apoptosis)是最常见的细胞程序死亡方式,目前临床使用的多数药物是通过诱导癌细胞凋亡来达到抗肿瘤目的,凋亡抵抗已成为了肿瘤化疗耐药的主要原因。副凋亡(Paraptosis)是一种非凋亡的细胞死亡模式,其主要特征是由于线粒体和/或内质网肿胀引起广泛的细胞质空泡化,MAPKs信号通路的激活介导了副凋亡的产生,发现诱导副凋亡的化合物可能为改善凋亡抵抗提供了新方向。桑(Morus alba L.)在中国已经有数千年的种植历史。Mulberry Diels-Alder加成产物(MDAAs)是桑科植物的特征性成分,在生物合成方面,该类化合物多由查尔酮和异戊二烯基酚类通过[4+2]环加成形成。MDAAs独特的结构和多样的生物活性引起了研究者的关注。前期,我们实验室从中药桑白皮中分离得到一个MDAAs化合物桑酮M(Kuwanon M,KWM),该化合物能够抑制人肺癌A549与NCI-H292细胞增殖和迁移,同时诱导细胞出现广泛的细胞质空泡化现象。基于前期研究基础,本课题对KWM开Medical implications展了进一步研究。结果表明,KWM引起的A549和NCI-H292细胞增殖抑制同时与凋亡和副凋亡相关。DAPI染色后观察到的细胞核固缩和碎裂;Annexin V-FITC/PI双染显示的凋亡细胞比例增加;蛋白PARP、Caspase 3/9的剪切增加,均表明KWM诱导了细胞凋亡的产生。线粒体膜电位(MMP)的丢失、细胞色素c由线粒体释放进入细胞质和Bax/Bcl-2的蛋白比例增加,表明KWM诱导A549和NCI-H292细胞发生线粒体介导的内源性凋亡。KWM处理的细胞出现了明显的细胞质空泡现象,而凋亡抑制剂Z-VAD(OMe)-FMK在部分拮抗KWM引起的细胞死亡同时,对细胞空泡的产生没有影响,推测KWM引起了除凋亡之外的其它方式的细胞死亡。经内质网和线粒体荧光探针染色成像,发现KWM引起的胞浆空泡来源于内质网肿胀和线粒体扩张,推测KWM引起了细胞副凋亡的产生。副凋亡分子标志物Alix经KWM处理后表达减少,以及MAPK信号通路的激活证实了副凋亡的产生。JNK抑制剂SP600125和ERK抑制剂U0126均能拮抗KWM引起的细胞死亡和胞浆空泡化,进一步证实KWLXH254M诱导A549和NCI-H292细胞发生了副凋亡。副凋亡的发生往往和持续的内质网应激(ER stress)有关。在细胞中,内质网主要负责蛋白质的合成、修饰和折叠。当内质网应激发生时,未折叠蛋白会在内质网管腔中积累,细胞为了恢复其稳态,启动未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR);而持续的、无法纠正的内质网功能紊乱,最终将引起细胞死亡。在A549和NCI-H292细胞中,KWM使内质网伴侣蛋白GRP78/Bip的表达增加,UPR信号通路的三条分支IRE1α、PERK、ATF-6均激活;蛋白合成抑制剂放线菌酮(Cycloheximide,CHX)和内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid,4-PBA)预处理均能逆转KWM引发的细胞活力下降和空泡产生,表明内质网应激介导了KWM引起的副凋亡。实验结果同时表明,内质网应激也介导了 KWM引起的A549和NCI-H292细胞凋亡。综上所述,KWM诱导肺癌A549和NCI-H292细胞同时发生了凋亡和副凋亡,并且内质网应激在此过程中发挥了关键作用,KWM有望成为一种潜在的肺癌治疗物质。帕金森病是世界上第二大常见的神经退行性疾病。随着人口老龄化,PD的发病率会持续增加,且呈现年轻化趋势,预计到2040年,全球PD患者将达到1400万,因此迫切需要开发有效的PD治疗药物。PD的主要病理特征是黑质致密部(SNc)和纹状体(Str)中多巴胺能神经元的进行性缺失,同时在Lewy小体中错误折叠的α-突触核蛋白(α-syn)聚集,从而导致运动功能障碍。PD的分子机制复杂,包括蛋白质稳态失衡、线粒体功能障碍和氧化应激、神经炎症和遗传因素等。铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖型的细胞死亡形式,越来越多的证据表明,铁死亡已成为神经退行性和心血管等多种慢性疾病防治的关键靶点。作为转录因子的一员,Nrf2(NF-E2-related factor 2)是细胞应对氧化应激的重要防御机制。Nrf2通过编码细胞内启动端包含抗氧化反应原件(Antioxidant Response Element,ARE)的靶基因的表达,调控细胞的氧化还原稳态。铁死亡最关键的调控因子GPX4被证明是Nrf2的靶基因之一,靶向Nrf2为治疗铁死亡相关疾病提供了选择。从Nrf2通路入手寻找铁死亡的干预分子用于治疗PD等LY2157299半抑制浓度神经退行性疾病是一条可行的途径。另外临床研究表明,在PD病人的SNc和Str部位存在活化的小胶质细胞及其诱发的炎症。MPTP、LPS、α-syn等可诱导小胶质细胞向M1型极化,产生炎性细胞因子和趋化因子,导致神经炎症和神经细胞死亡;而M2型小胶质细胞能够释放抗炎介质,促进组织修复。因此,平衡小胶质细胞M1/M2极化在神经退行性疾病中具有良好的治疗前景。甘草素(Liquiritigenin,LG)是课题组前期从甘草(Glycyrrtiza Fisch.)中分离得到的二氢黄酮类化合物,该化合物具有Nrf2通路诱导作用。我们首先采用MPTP构建急性PD小鼠模型评价了 LG对于PD的有效性,结果表明LG可以缓解PD小鼠出现的运动障碍,促进SNc和Str中酪氨酸羟化酶(TH)的表达增加,同时促进尼氏小体的生成,对MPTP造成的神经损伤具有保护作用。为了进一步探究LG的神经保护机制,我们用多巴胺能神经元SH-SY5Y细胞和小胶质HMC3细胞进行了体外研究。结果表明,LG能够激活神经元细胞的Nrf2信号通路,延长Nrf2蛋白半衰期,拮抗MPP+引起的铁死亡和凋亡,以及Erastin诱导的细胞铁死亡,改善细胞形态。Nrf2的沉默实验结果表明,LG依赖Nrf2对SH-SY5Y细胞发挥保护作用。同时,MPP+和LPS可以诱导小胶质细胞HMC3转化为M1型,LG预处理可以促使HMC3由M1型向M2型转化。共培养的结果表明LG诱导HMC3自我保护的同时,也会保护SH-SY5Y细胞对LPS诱导的炎性损伤产生抵抗。综上所述,研究结果表明LG具有神经细胞保护作用,这种保护作用包括了对于神经元细胞的直接保护以及小胶质细胞的激活抑制,对于帕金森病的治疗,LG有可能成为一种潜在的候选物质。