两歧双歧杆菌CCFMHerpesviridae infections16具有调节肠道平衡、缓解便秘、改善抑郁症等功效,安全性高,被广泛用于益生菌制剂的开发。渗透胁迫是双歧杆菌高密度培养过程中限制其增殖的主要因素,而两歧双歧杆菌CCFM16耐渗透压能力差,使其产业化应用受到制约。本研究首先将适应性进化技术应用于两歧双歧杆菌CCFM16,筛选获得具有耐高渗透特性的突变菌株,其次通过全基因组比较、候选基因应激表达和三维蛋白结构模拟定位关键突变基因,然后对驯化不同阶段菌株的代谢产物进行比较,找出关键差异物质,提出两歧双歧杆菌CCFM16渗透耐受性的可能机制,最后基于此理论依据,对菌株培养工艺进行优化。本研究揭示了两歧双歧杆菌渗透压耐受提高的关键分子机制,为其高密度培养提供了理论指导。主要研究结果如下:(1)利此网站用适应性进化获得两歧双歧杆菌CCFM16耐渗透压突变株。通过连续增加液体培养基的渗透压进行逐级传代驯化,在700 m Osm/kg、1000 m Osm/kg、1300m Osm/kg固体平板上筛选得到耐渗透压突变株CCFM16-700、CCFM16-1000和CCFM16-1300,对其进行耐渗性分析。结果表明,CCFM16-1300在渗透压为1300m Osm/kg(3.0%Na Cl)培养基中生长速率是原始菌株CCFM16的3倍,且耐渗透压能力能稳定遗传。(2)利用全基因组重测序技术筛选突变株中与渗透压耐受性相关的突变基因。由Illumina Hi Seq平台完成3株耐受不同渗透压的突变株的基因组重测序,对其基因组进行逐一比对,共有20个SNP注释到基因组上,其中13个基因编码的氨基酸发生改变,6个突变的氨基酸处于功能域内。其中基因ccfm16＿290、ccfm16＿1673、ccfm16＿1898的表达与渗透应激表现出高度一致性,编码的蛋白分别和谷氨酰胺的代谢、谷氨酸转运、以及谷氨酸合成有关。对突变前后的基因进行3D蛋白结构模拟预测发现并未引起结构损伤。(3)通过代谢组学进一步确定耐渗透压的关键分子调控机制。对不同驯化阶段的突变菌株进行代谢组学分析,并比较代谢产物。结果表明,差异代谢物主要为糖类和氨基酸,并且随着驯化的进行,胞内葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖和木糖的积累都有不同程度的减少,但“双歧途径”的关键酶活却随生长削弱而增强。与之相反的是除瓜氨酸含量减少外,其他关键差异氨基酸含量均呈增加趋Decitabine核磁势,其中脯氨酸增加最为显著。此外,当渗透应激增加到一定程度,谷氨酸积累开始减少,且关键突变基因均与谷氨酸合成或转运相关,说明在长期的高渗透胁迫下,突变菌株进化出了一种由谷氨酸合成脯氨酸的渗透保护系统,并且以牺牲基础代谢来提供能量。(4)验证耐渗透压调控途径的激活对菌株生长的影响。对两歧双歧杆菌CCFM16进行基因组分析,结果表明其不具备脯氨酸转运系统,但具有较为完善的肽转运和水解体系。合成含有脯氨酸的二肽、三肽和九肽,发现二肽FP(Phe-Pro)的添加,能够使两歧双歧杆菌CCFM16的生长密度和冻干存活率分别提升15.74%和32.48%,但三肽VPY(Val-Pro-Tyr)的添加并无明显效果,这说明含有脯氨酸的多肽有助于菌株的生长但具有选择性。(5)两歧双歧杆菌CCFM16最适培养工艺。通过比较不同氮源和微量元素对菌株增殖效率的影响,优化出最适底物和限制性微量元素,并基于生长抑制因素优化底物浓度、比例和培养工艺条件。优化结果为:30 g/L葡萄糖、26 g/L胰酪蛋白胨、0.26 g/L Mg SO_4·7H_2O、1 m L/L吐温80、1 g/L半胱氨酸盐酸盐,恒p H 6.5培养18 h的最高活菌数达(3.70±0.61)×10~9 CFU/m L,是MRS培养基恒p H分批培养的3倍。通过酶解酪蛋白得到富含脯氨酸的多肽混合物,在培养8 h时以5 g/L添加,发酵液最高活菌数可以达到(5.75±0.13)×10~9CFU/m L,冻干存活率达到59.77%,分别比不添加提高了55.40%和27.38%。