作为一种天然多糖,透明质酸(Hyaluronicacid,HA)的来源广泛,生物活性良好,无论是在医药还是生活方面都得到了极大的应用。目前卫建委已确认细节经批准透明质酸钠作为食品添加原料,但由于HA的分子量差异较大导致生物活性也存在差异。因此,阐明不同分子量的HA口服转运机制,将为更好地发挥其生物学活性提供理论指导。本实验室前期成功建立了 5天CacoJammed screw-2细胞单层模型,在此基础上,采用异硫氰酸荧光素(Fluoresceine isothiocyanate,FITC)标记的方法合成 10kD、40～100kD 和 100～200kD 的 FITC-HA,来研究不同分子量HA的口服转运效果和机制的差异性,为HA 口服吸收的分子量选择提供实验依据。本课题取得的主要成果如下:1.不同分子量HA的荧光标记和结果验证本实验通过酪胺法和还原胺化法将10 kD、40～100 kD和100～200 kD的HA与FITC进行缀合,然后使用透析和AKTA Pure对粗产物进行分离纯化和初步检测,再利用琼脂糖凝胶电泳、多功能酶标仪、苯酚硫酸法验证了纯化产物的荧光吸收和糖含量,证明三种不同分子量的HA已经被成功标记,并得到10 kD、40～100 kD和100～200 kDFITC-HA的单位摩尔标记量平均值分别为25.19、11.24、6.22。2.5天Caco-2细胞单层模型的优化通过在7天Caco-2细胞单层模型基础上添加50μg/mL岩藻聚糖硫酸酯建立了 5天模型,并确认了该5天模型与7天模型在跨膜电阻值、碱性磷酸酶活性和渗透性标志物荧光黄、FITC、转铁蛋白和葡聚糖的转运效果上不存在差异。然后在5天模型上首次进行了体外大分子药物(上述合成的FITC-HA)和小分子药物阿霉素(Doxubicin,DOX)PD-0332991 NMR的转运实验,并与7天模型中的实验结果进行对比,针对HA转运结果的差异性,对5天模型提出使用方法优化,使10kD和100～200kDFITC-HA在该模型中的转运情况得到大幅改善,显示可以被良好吸收,表观渗透系数(Apparentpermeability coefficient,Papp)分别为3.02×106 cm/s和2.33×106 cm/s。还对比了葡聚糖、转铁蛋白以及小分子药物DOX在优化模型与7天模型中的转运结果,显示没有差异,这说明优化方法是符合Caco-2细胞单层模型使用标准的,也为其他药物的体外转运实验提供了更高效的模型选择。3.不同分子量HA在Caco-2细胞单层模型中的转运机制研究在优化模型中研究了 10kD和100～200kD两种属于不同分子量量级的HA在肠上皮细胞中的转运效果和机制,结果表明Caco-2细胞对10kD和100～200kDHA的摄取量会随着时间增多,且需要消耗能量,但随着时间延长会出现外排情况,转运量不会一直增加,这说明细胞上的转运载体数量有限会出现饱和,同时二者由于分子量差异导致转运效果也有明显不同,10 kD HA会比100～200 kD HA的转运效果更好,Papp值也更高。随着抑制剂氯丙嗪(Chlorpromazine,CPZ)和 Dynamin GTPase 抑制剂(Dynasore)的加入,10 kD 和 100～200 kD FITC-HA 的 Papp 值分降低了 84.61%和 28.15%、41.41%和60.06%,但是甲基-β-环糊精(Methyl-β-cyclodextrin,MβCD)对 10 kD 和 100～200 kD FITC-HA几乎没有影响,这说明10 kD和100～200 kD FITC-HA的转运可能受网格蛋白介导的内吞途径影响,但是受小窝(脂筏)蛋白的作用比较小。对于巨胞饮途径,在给药 TRPP3 channel 抑制剂(TRPP3 channel inhibitor,EIPA)后,10 kD 和 100～200 kD FITC-HA的转运抑制率分别为6.18%和89.25%,表现出明显差异;对于胞内转运过程,在加入莫能菌素(Monension)后,二者的转运抑制率分别为89.99%和60.47%,这表明10 kD和100～200 kD HA的转运可能都和内体酸化到溶酶体成熟的过程有关;对比加入诺考达唑(Nocodazole)后,100～200kDHA转运率下降了 82.26%,但对10 kDHA影响不大,这说明还有一部分100～200 kDHA是依赖微管蛋白在胞内进行迁移转运的。综上所述,本实验课题用FITC对10 kD、40～100 kD和100～200 kD的HA进行了荧光标记,在优化后的Caco-2细胞单层模型中研究了 10kD和100～200kD的FITC-HA的转运机制以及差异性,结果表明10 kD和100～200 kD HA的转运都是时间和能量依赖性的,但10 kDHA的转运效果明显更高。在内吞途径中,10kD和100～200kD HA都表现出网格蛋白依赖性的胞吞转运机制,同时100～200 kD HA也依赖巨胞饮作用;在Caco-2细胞内的转运过程,10kD和100～200 kDHA都受内体酸化的影响,同时还有部分100～200 kD HA依赖于微管蛋白的介导转运。本课题全面阐述了不同分子量HA 口服吸收转运机制以及差异性。