伊立替康(喜树碱-11,CPT-11)是7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的前体药物,通过抑制拓扑异构酶I进而阻止DNA复制来发挥疗效,主要用于治疗晚期或复发性结直肠癌及其他实体肿瘤。由于伊立替康的内酯环结构不稳定,在生理条件下易开环失活,其在人体内消除半衰期约为6小时,活性代谢物SN38的转化率仅为2-8%,且存在骨髓毒性及胃肠道毒性,导致其临床应用受限。聚乙二醇(PEG)化修饰技术因其可改变药物的药代动力学性质,延长药物体内循环时间,提高药物生物利用度,降低不良反应发生率,被越来越多的用于修饰抗肿瘤小分子药物,以实现其“增效减毒”。为克服伊立替康的临床局限性,天津键凯科技有限公司成功地开发了三价PEG化伊立替康(PEG-[CPT-11]_3),该药目前已经进入II期临床试验。PEG-[CPT-11]_3由三个部分组成:一个20 k Da的直链m PEG(PEG20K),一个不对称三载药点的连接臂以及三分子CPT-11。不同于小分子药物,对多价PEG修饰后的小分子药物进行全轮廓的体内外精准分析,一直是药物分析与药代动力学研究领域亟待突破的关键科学问题。究其原因在于:1)目前,药物分析首选的技术手段是基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的多重反应监测扫描模式(MRM),然而,高分子PEG化药物分子量成多分散性,在质谱检测过程中可产生带有多种电荷与多种加合离子的难以计数的前体离子,而MRM的LC-MS/MS受质谱扫描速度的限制,只能对有限个目标分子进行定量分析,因此无法满足PEG-[CPT-11]_3无数前体离子全轮廓分析的需求;2)PEG-[CPT-11]_3整体属于多载药聚合物-药物偶联物,除了每个PEG分子连有3分子的CPT-11原形药物以外,至少还可能存在分别连接2,1,0个分子的CPT-11,即,PEG-[CPT-11]_2、PEG-[CPT-11]和PEG20K;3)CPT-11是前体药物,分子内已经含有一个内酯的“代谢软点”,其与PEG偶联后,在体内可能会派生出两种并行的代谢释药行为,即PEG-[CPT-11]→PEG20K+CPT-11→SN38和PEG-[CPT-11]→PEG-[SN38]→PEG20K+SN38;4)PEG部分在体内也会被代谢,而这种代谢既会发生在完全释药后的PEG20K,也可能发生在载药的PEG部分;5)PEG-[CPT-11]_3及其体内代谢产物PEG-[CPT-11]_2,PEG-[CPT-11],PEG20K和CPT-11具有相同的特征性碎片,质谱无法对其进行有效区分,色谱分离充满挑战。如上所述,由于缺少适合的分析策略和手段,人们对这类复杂高分子键合药的体内命运尚不清楚。针对PEG化小分子药物体内不明确的释药过程、药代动力学行为以及不确定的潜在毒性,本论文以PEG-[CPT-11]_3作为研究对象,基于LC-ESI-TOF MS技术建立全轮廓的定性及定量分析方法,并对PEG-[CPT-11]_3的吸收、分布、代谢、排泄、释药过程、抗肿瘤疗效及毒性进行了全面系统的研究,实现了多价PEG化小分子药物体内命运全轮廓分析从无到有的突破,为高分子键合药的临床及临床前研究提供有力的药代动力学理论基础与技术支持,加速了该类药物的临床转化速度与成功率。本论文的具体研究内容如下:(1)PEG-[CPT-11]_3、PEG20K及CPT-11的质谱裂解规律研究基于高分辨飞行时间质谱(ESI-TOF MS)结合全谱扫购买Compound 3描(MS ~(ALL))策略,分别对CPT-11、PEG20K和PEG-[CPT-11]_3的质谱裂解规律进行研究,并对各待测物特征性碎片进行解析及归属,首次发现了PEG-[CPT-11]_3的特征性碎片m/z 569.2740。依据碎片的特异性及响应强度,最终确定PEG20K和CPT-11的定量碎片分别为m/z 177.1098和m/z 587.2901。质谱裂解规律解析及定量碎片的确定为后续LC-ESI-TOF MS定量分析方法的建立以及各代谢产物的鉴定提供了前提条件。(2)PEG-[CPT-11]_3的大鼠血浆药代动力学研究开发可实现具有相同碎片且极性相似各组分基线分离的液相方法。创新性地建立PEG-[CPT-11]_3及其体内五种代谢产物PEG-[CPT-11]_2,PEG-[CPT-11],PEG20K,CPT-11和SN38在大鼠血浆中的提取方法及LC-ESI-TOF MS检测方法。以盐酸伊立替康作为对照组,对PEG-[CPT-11]_3药代动力学进行研究并揭示PEG-[CPT-11]_3的释药过程。PEG-[CPT-11]_3组CPT-11和SN38的半衰期分别是对照组的7倍和4.5倍,AUC_(0-t)分别是对照组的2-3倍,显著高于对照组(P<0.05)。此外,PEG-[CPT-11]_3组SN38的C_(max)明显低于对照组(P<0.05)。结果表明,PEG-[CPT-11]_3逐步释放CPT-11形成PEG-[CPT-11]_2,PEG-[CPT-11]和PEG20K,与此同时,释放的CPT-11被代谢为SN38。PEG-[CPT-11]_3有潜力降低SN38产生的毒性,保障患者用药安全性。(3)PEG-[CPT-11]_3的荷瘤鼠组织分布研究以人结直肠癌(HCT-116)荷瘤鼠为动物模型,基于本文已建立的全轮廓分析新方法,分别考察了PEG-[CPT-11]_3和盐酸伊立替康的组织分布。PEG-[CPT-11]_3组及盐酸伊立替康组中CPT-11和SN38在荷瘤鼠各组织中的分布趋势相似,CPT-11主要分布于肿瘤组织,SN38主要分布在大肠和小肠,其次是肝和肿瘤。48小时PEG-[CPT-11]_3组CPT-11和SN38在肿瘤组织浓度分别是对照组的86.2和2293倍,组织暴露时间更长。PEG-[CPT-11]_3在组织中的释药过程同血浆中一样,逐步释放CPT-11,延长了活性代谢产物SN38在肿瘤组织的暴露时间,有效改善了CPT-11抗肿瘤的疗效。(4)PEG-[CPT-11]_3的代谢研究基于碱水解和衍生化方法对PEG-[CPT-11]_3的高分子代谢产物进行考察,本文首次发现并表征了五种高分子代谢产物:PEG-[CPT-11]_2,PEG-[CPT-11],PEG20K,PEG_(10K)-[CPT-11]_(3-x)(x=0,1)和PEG10K,并且发现,除了逐步释放CPT-11形成的高分子代谢物,大鼠尿液中还存在因体内代谢而产生的更低聚合度PEG化伊立替康和更低聚合度的PEG。另外,以盐酸伊立替康作为对照组,对PEG-[CPT-11]_3体内产生的伊立替康相关小分子代谢产物进行了考察。相同考察时间内,对照组共检测到10种伊立替康相关代谢产物:SN38、SN38G、APC、NPC、M1～M6,其中主要代谢产物为SN38、SN38G和M4(CPT-11的羧酸型),PEG-[CPT-11]_3组共检测到SN38和SN38G两种伊立替康相关代谢产物。上述结果表明:PEG修饰后改善了CPT-11的结构稳定性,降低了其代谢失活生成羧酸型CPT-11的比例,使其可以更多地被转化为活性代谢SN38,进而提高抗肿瘤的疗效。(5)PEG-[CPT-11]_3的排泄研究研究发现PEG-[CPT-11]_3及其高分子代谢产物大部分经尿排泄,尿排泄是其主要排泄途径;盐酸LY-188011临床试验伊立替康对照组中CPT-11和SN38在尿液中的累计排泄率分别为11%和1%,在粪便中的累计排泄率分别为18%和5%。PEG-[CPT-11]_3组中对应的累计排泄率分别为4%和3%以及6%和17%。这提示,PEG修饰改变了CPT-11和SN38的排泄量和排泄率,进一步证实了经PEG修饰后CPT-11可以被更多地转为SN38活性代谢产物。(6)PEG-[CPT-11]_3的药效学和毒性研究以人结直肠癌(HCT-116)荷瘤鼠为动物模型,考察了PEG-[CPT-11]_3的体内抗肿瘤效果。与生理盐水对照组相比,盐酸伊立替康和PEG-[CPT-11]_3均能延缓肿瘤生长,且PEG-[CPT-11]_3的抗肿瘤疗效优于盐酸伊立替康。基于体重、食量、临床观察及组织学检查对大鼠的重复剂量毒性进行考察。盐酸伊立替康组出现3例动物死亡,存在系统毒性及骨髓毒性,而PEG-[CPT-11]_3组未观察到明显的系统毒性及骨髓毒性,提示PEG-[CPT-11]_3的安全性更高。综上所述,本文以PEG-[CPT-11]_3作为模型药物,首次从时间、空间维度上全面揭示了多价PEG化小分子药物的体内命运:1)PEG-[CPT-11]_3在体内逐步释放CPT-11,并相继代谢生成PEG-[CPT-11]_(3-x)(x=1,2)和PEG20K,释放出来的CPT-11再被高效地快速转化为活性代谢产物SN-38;2)与此同时,PEG-[CPT-11]_Lab Automation3在体内还可以进一步代谢生成更低聚合度的PEG化伊立替康及更低聚合度的PEG;3)与盐酸伊立替康相比,PEG修饰改善了CPT-11内酯环结构的稳定性,降低CPT-11代谢失活的比例,提高了其向SN38活性代谢产物的转化效率,延长了CPT-11和SN38的血浆半衰期及其在肿瘤组织的暴露时间,提高了抗肿瘤疗效和安全性。本论文的研究思路和技术手段对于阐明高分子键合药的体内时空命运具有十分重要的意义,藉此可以指导该类药物的科学设计与工艺优化,将大大提高该类药物的临床转化成功率。