丁香酚(eugenol,Eug)是一种具有特殊香气的淡黄色酚类化合物,也是丁香油的主要活性成分。研究表明,Eug具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫调节、镇痛、抗癌等多种药理作用,且具有较好的安全性,美国食品和药物管理局(FDA)已将其纳入食品添加剂目录。但Eug存在挥发性高、水溶性差、稳定性和生物利用度低等缺陷,限制了其功效的发挥,因此亟需研发新的剂型来提高其应用效果。脂质体是一种可在水性介质中通过两性基团而发生自组装的双层囊泡载体系统。药物包CP-456773采购裹在脂质体囊泡后可增强其溶解度和稳定性,并减少药物降解。此外,脂质体的控释特性可以延长药物在血液中的循环时间,同时减小副作用,降低各类药物的靶向毒性。本研究采用薄膜水合超声法将Eug装载于脂质体中,制备了丁香酚纳米脂质体(eugenol nano-liposome,ENL),采用 Box-behnken 设计(BBD)响应面法优化了其制备工艺,对ENL形态结构和释放等性能进行了表征;然后评价了其对大肠杆菌(Eschericha coli,E.coli)的体内外抑菌效果,为Eug新型制剂的研发提供技术支撑。1.ENL的制备及BBD响应面法优化为解决Eug易挥发、难溶于水和不稳定等问题,采用薄膜水合超声法将其制备成ENL,并通过有机溶剂萃取法、破乳法计算ENL的实际包封率。为确定其制备条件,对ENL进行五因素五水平的单因素分析,分别为大豆卵磷脂与胆固醇的质量比(W/W)、Eug浓度(%)、吐温-80质量(mg)、水化温度(℃)、超声时间(min)。选取其中对包封率影响最大的前三个因素,以BBD响应面法优化制备工艺。结果显示:最佳制备工艺是大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为5.4:1、Eug浓度为1.5%、超声时间为10 min。据此获得的包封率平均值为72.42±0.22%,与预测包封率72.51%接近。这表明,单因素分析结合BBD响应面法优化可以获得较高包封率的ENL。2.ENL的性能表征为表征ENL的性能,对其形态、粒径、多分散指数(PDI)、Zeta电位、傅里叶红外光谱(FTIR购买BYL719)、缓释性和稳定性进行了考察。通过透射电子显微镜(TEM)观察ENL的超微结构;使用纳米粒度分析仪测定其粒径大小和Zeta电位;以溴化钾(KBr)压片法扫描获得其红外光谱;模拟体内胃肠环境,采用透析法和紫外分光光度法测定ENL中Eug的体外释放量;将ENL分别置于4℃、25℃两种条件下45 d,分别测定其粒径及PDI变化来测定ENL的储存稳定性。结果表明:ENL的形态近似球形,大小均一;平均粒径为 203.97±8.66nm,PDI 为 0.23±0.03、Zeta 电位为-2.18±0.18mV;Eug 的特征峰在ENL中进行了红移和蓝移,可能是氢键相互作用;ENL在胃、肠模拟液中缓慢释放;并且在4℃和25℃两种条件下可稳定储存45 d。以上结果表明,薄膜水合超声法制备的ENL具有良好的稳定性和缓释性。3.ENL的体外抑菌作用研究为探究ENL对E.coli的体外抑菌作用,本试验采用微量肉汤稀释法和琼脂扩散法测定ENL对E.coli的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC);将ENL分别在4℃和25℃两种条件下放置0d、7d、15 d、30 d和45 d,检测其对E.coli的抑菌作用变化;通过酶标仪测定不同浓度药物处理后E.coli在不同时间段的OD600,并绘制生长曲线;使用2MIC、4MIC浓度的ENL在不同时间点分别处理E.coli,测定其菌落数,并绘制时间-杀菌曲线;使用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察药物处理后E.coli的形态结构变化;将不同浓度药物处理后的E.coli与荧光探针1-N-苯基萘胺(NPN)、碘化丙啶(PI)共同处理后,通过荧光显微镜观察Ecoli细胞外膜和内膜的变化。结果显示:ENL对 E.coli菌株的MIC为0.31 mg/mL,MBC为0.63 mg/mL,抑菌效果比Eug增强了 2～4倍;45 d内ENL具有较好的抑菌稳定性,两种储存条件下的ENL对E.coli的MIC、MBC几乎没有变化;2MIC的ENL处理2 h可杀灭标准株ATCC25922,12 h可杀灭临床分离耐药株E.coliAHM5C23;4MIC的ENL处理4 min可杀灭标准株ATCC25922,10 min可杀灭临床分离耐药株E.coli AHM5C23。SEM和TEM结果发现,ENL处理后会引起菌体发生严重的皱缩、细胞膜破损、细胞壁和菌毛等结构消失;荧光显微镜结果表明,ENL可破坏E.coli的细胞外膜和内膜,增加其通透性,并呈现一定的药物浓度依赖性。以上结果表明,ENL对E.coli具有明显的抑杀作用,主要是通过破坏其细胞膜而引起的。4.ENL对E.coli性肠炎的治疗作用研究为探究ENL对E.coli性肠炎的体内治疗效果,本试验首先通过给BALB/c小鼠灌服临床分离耐药株E.coli(AHM5C23)建立肠炎模型,建模后使用不同浓度的ENL(5、10、20mg/kg)对其进行治疗,4d后将小鼠处死,病理解剖并采样,然后通过死亡率、体重和脏器指数、肠道组织病理变化和小肠吸收能力、肠道组织炎性细胞因子以及肠道组织炎症相关蛋白的表达,来判定ENL对E.coli感染性肠炎的治疗效果。结果表明:与空白组相比,模型组小鼠存活率为80%,体重明显下降,肝脾指数显著增加,回肠和结肠HE染色结果呈现明显的肿胀、肠壁变薄、绒毛萎缩、出血、炎性细胞浸润、绒隐比(V/C)显著降低等病理变化;ENL治疗组小鼠未出现死亡情况,上述症状明显改善。RT-qPCR检测发现,ENL治疗可明显抑制肠道组织炎症细胞因子NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达;Western blot检测证明,ENL治疗可显著抑制肠道组织炎症相关蛋白TLR4、MyD88、p-P65、p-IκB的表达。以上结果表明ENL具有明显的抗炎作用,可显著抑制细菌性肠炎所引起的NF-κB信号通路的过度激活,而发挥良好的治疗作用。综上所述,BBD响应面法优化制备条件后,可以得到较高包封率的ENL,其为大小均一的球形,具有较小的粒径、缓释性和储存稳定性。同时,ENL对多株耐药E.coli菌株具有明显抑制作用,并可在几分钟内杀灭细菌;这与其破坏菌体细胞膜使菌体发生皱缩和破lethal genetic defect损有关。此外,ENL抑制E.coli感染诱导的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路活化,下调炎症细胞因子NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达而对E.coli感染性肠炎具有治疗作用。以上结果表明,ENL具有良好的体内外抑菌抗炎作用,有望成为一种新型替抗药物。