苹果是人们日常生活中最常见的水果,在贮藏和运输过程中极易受到损伤,从而被病Ubiquitin抑制剂原真菌侵染。扩展青霉(Penicillium expansum)引起的青霉病是苹果最主要的采后病害之一,造成的腐烂损失也非常严重。目前,对苹果采后青霉病的防治主要依赖化学杀菌剂,虽然防治效果好,但存在着食品安全、诱导抗药性菌株产生和环境药物残留污染等问题。因此,研发安全性高、控制效果好的病害防治方法具有重要的意义。ε-聚赖氨酸(Epsilon-poly-L-lysine,ε-PL)是一种天然的食品防腐剂,进入人体后可分解为人体必需的赖氨酸,安全无毒。ε-PL在柑橘、冬枣和番茄等果实采后病害防治中的应用研究已开展,但其对苹果采后病害防治效果的研究较为罕见。为探索安全、高效的苹果采后青霉病控制方法,本论文研究了ε-PL对苹果采后青霉病的防治效果,揭示了ε-PL体外抑制P.expansum的可能机制,并在生理生化、组学水平结合基因功能验证,揭示了ε-PL控制苹果采后青霉病的生理机制和分子机制。研究结果可为苹果采后青霉病的防控提供了新的思路和理论参考,具有较好的理论意义和实际应用价值。论文主要研究结果如下:(1)ε-PL对苹果的诱导处理能有效控制苹果的自然腐烂及由苹果损伤接种引起的腐烂,且对苹果的贮藏品质无不良影响。体外试验表明,ε-PL对P.expansum的抑制效力与其浓度呈正相关,浓度在200 mg/L以上对P.expansum孢子萌发、芽管伸长及菌丝生长具有显著的抑制作用。体内试验表明,600 mg/L的ε-PL对苹果采后青霉病具有最佳的控制效果。ε-PL诱导处理效果优于直接处理,最佳诱导浓度为600 mg/L,最佳诱导时间为24 h。ε-PL在苹果体内对P.expansum的控制效果与接种孢子的浓度呈负相关,600 mg/L的ε-PL诱导处理苹果可以显著控制由低浓度孢子引起的青霉病,但对高浓度孢子引起的青霉病控制效果减弱。(2)ε-PL对苹果采后青霉病的控制是由ε-PL对P.expansum孢子完整性的破坏、诱导苹果分泌的抗性酶和抗性物质共同作用的结果。ε-PL体外处理P.expansum会导致其孢子内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的迸发,过量的ROS会氧化损伤孢子细胞膜,使大量胞内物质泄漏,从而抑制孢子萌发和菌丝生长。在苹果体内,ε-PL既能有效抑制P.expansum孢子萌发和芽管伸长,也能激发苹果组织的系统抗性反应,600 mg/L的ε-PL能诱导苹果抗性相关的多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)和几丁质酶(Chitinase,CHI)活性的提高及其编码基因的上调表达,也能诱导苹果分泌总酚、类黄酮和木质素等抗性相关物质,增强其对青霉病的抗性。(3)ε-PL处理增强苹果对青霉病的抗病能力,与其调节苹果的呼吸代谢、ROS代谢和膜脂代谢有关。ε-PL处理能提高苹果呼吸代谢关键酶的活性,主要包括EMP和TCA途径中限速酶的活性以及呼吸链细胞色素c氧化酶(Cytochrome oxidase,CCO)的活性,加速EMP、TCA及呼吸链进程,从而提高苹果的ATP、ADP含量和能荷(Energy charge,EC)水平,增强苹果对青霉病的抗病能力。ε-PL处理可以诱导提高苹果ROS代谢相关抗氧化酶活性,有效清除苹果机体内过多的超氧阴离子(O_2~(-·))、H_2O_2和丙二醛(Malondialdehyde,MDA),减少ROS对苹果细胞膜的氧化损伤。此外,ε-PL处理能有效抑制膜脂代谢中促进膜脂降解的磷High-Throughput脂酶D(Phospholipase D,PLD)、脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX)和酯酶的活性,降低磷脂的水解程度,保护细胞膜的完整性。(4)ε-PL可以通过调节苹果代谢通路中抗性相关基因的表达,来提高苹果对青霉病的抗性。转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)结果分析表明,ε-PTamoxifen化学结构L可以诱导苹果在ROS信号转导、Ca~(2+)信号转导、PAMP触发免疫反应(PAMP-triggered immunity,PTI)和效应蛋白触发的免疫反应(Effector-triggered immunity,ETI)启动过程中以及ROS合成途径中相关基因的上调表达,从而促进ROS爆发,产生局部抗性超敏反应(Hypersensitive response,HR),引起细胞加固及气孔关闭,以提高苹果对外源胁迫的抵御能力。ε-PL也可以诱导抗性物质合成基因和抗氧化酶POD、PPO和谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)编码基因的上调表达,增强果实的抗病能力。此外,ε-PL可以调节细胞强度相关酶编码基因的表达,来提高苹果细胞壁、角质层强度。在未接种P.expansum情况下,ε-PL诱导苹果果胶水解酶、纤维素水解酶编码基因的下调表达,木质素、角质蜡合成基因的上调表达。而在接种P.expansum情况下,ε-PL可诱导苹果果胶酯酶、纤维素水解酶编码基因的下调表达,木质素、果胶合成酶、角质蜡合成基因的上调表达。(5)ε-PL可以激发苹果的系统获得性抗性(Systematic acquired resistance,SAR),其对苹果抗性诱导依赖于水杨酸(Salicylic acid,SA)途径,且与MAPK级联信号转导密切相关。RNA-seq结果表明,在未接种P.expansum情况下,ε-PL可直接激活SA途径中防御相关基因NPR1、TGA10和PR1的上调表达,启动SAR。在接种P.expansum情况下,ε-PL诱导PAL1基因的上调表达积累SA,进而激发TGA9、TGA4和PR1的上调表达,促进病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)在整果范围内的表达,提高果实对青霉病的抗病能力。此外,MAPK级联在ε-PL诱导苹果抗性的信号转导中发挥着枢纽作用,ε-PL可以激活苹果细胞MAPK级联途径来响应外界胁迫及P.expansum的侵染,参与抗病基因的转录激活、植保素(Phytoalexins,PA)的合成、细胞壁加强、HR、ROS迸发、气孔闭合及植物激素信号的转导。(6)ε-PL在苹果体内可抑制P.expansum抗氧化基因、致病基因、能量代谢相关基因及细胞功能和细胞完整性相关基因的表达。ε-PL在苹果体内可有效抑制P.expansum细胞的抗氧化酶编码基因SOD2、CAT、tpc F、hx A、dao1的表达,降低其细胞清除ROS的能力。也可抑制P.expansum细胞壁水解酶(Cell wall degrading enzymes,CWDEs)编码基因pme A、ply A和bgl G的表达,减弱其对细胞壁的降解能力;还使EMP、TCA循环和氧化磷酸化等能量代谢途径的限速酶编码基因下调表达,导致ATP合成量不足,减弱P.expansum对逆境的抵御能力。此外,ε-PL在苹果体内可抑制P.expansum细胞膜脂合成酶、麦角甾醇合成酶和多药物转运蛋白等编码基因的表达,阻碍了分生孢子的分化,破坏了其细胞膜的完整性。(7)基于农杆菌介导转化(Agrobactirium tumfacience mediated-transformant,ATMT)的同源重组技术,成功构建了hx A基因敲除突变株Δhx A和回补株Δhx A-C,并验证了hx A为P.expansum对苹果的关键侵染基因,进一步解释了ε-PL控制苹果采后青霉病与hx A在苹果体内的表达受到抑制有关。利用Cytoscape软件分析P.expansum中与hx A具有互作关系的基因,发现与hx A关联度高的基因共有702个(|Cor|>0.8且P<0.05),而高度关联且下调表达的基因有19个,这些基因与P.expansum的抗氧化能力、侵染力、ATP合成能力及细胞功能和完整性相关。