随着生活方式的改变,我国居民膳食结构中糖脂类比例增加,加以不良的生活作息和精神压力,人们越来越易受到与代谢紊乱相关的疾病的影响,因体内脂质代谢紊乱而产生的脂毒性受到更多关注。脂毒性指游离脂肪酸(Free fatty acids,FFAs)的异位沉积及随后产生的一系列氧化应激损伤现象。经研究发现非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病(Diabetesmellitustype2,T2DM)、高脂血症、甲亢、心血管疾病等患者体内均呈现血脂水平异常升高。脂代谢与糖代谢相互影响,共同决定了机体能否获得足够能量供应。因脂代谢紊乱产生的胰岛素抵抗可使细胞对葡萄糖的摄取利用降低。在对阿尔茨海默病等神经退行性疾病研究中发现,葡萄糖摄取代谢的降低可使脑能量供应短缺,导致脑细胞功能失调、毒性蛋白累积,最终引起认知下降和神经精神症状。改善血脂水平,降低脂毒性损害,提高机体细胞对葡萄糖的摄取能力对治疗此类疾病具有重要意义。这对肝细胞脂毒性同样有价值。目前应用降脂药辅以合理饮食是改善血脂水平的常用治疗方案。广泛应用的降血脂的药物包括他汀类、贝特类、烟酸类等,主要调控血液内胆固醇、高低密度脂蛋白和甘油三酯含量,而对其他血脂成分如脂肪酸、神经酰胺、甘油二酯等靶向性较弱,FFAs含量增加是产生脂毒性的最重要因素。临床上需要安全有效的改善FFAs水平的药物,以遏制脂毒性的产生。环糊精(Cyclodextrin,CDs)是一种安全稳定的环状低聚糖化合物,具有外部亲水、内腔疏水的物理性质。在医药、食品、农业、纺织等领域均有应用。在医药领域多用作药用辅料,可增加药物溶解度,掩盖药物不良气味,减轻胃肠或皮肤对刺激性药物的反应等。近年来逐渐发现环糊精作为药物治疗疾病的潜力。HP-β-CD可以通过静脉注射治疗尼曼匹克C型疾病,γ-环糊精衍生物可作为拮抗剂,结合氨基甾类肌松药,逆转深度和中度肌肉松弛状态。本课题组前期研究显示,环糊精的疏水性空腔可以包合脂多糖的类脂A链,发挥抗脓毒症的作用。本课题探讨利用环糊精疏水性空腔可包合脂类的特性,降低血脂中主要的饱和脂肪酸——棕榈酸对HepG2细胞的脂毒性可行性。本课题取得的结果及主要结论有:1环糊精与棕榈酸(Palmitic acid,PA)的结合作用利用棕榈酸和茜素红S(Alizarin Red S,ARS)竞争环糊精疏水空腔的特性,考察了 α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD及阳离子-CD与棕榈酸的体外相互作用。在无棕榈酸存在的情况下,荧光最强,在加入不同浓度的棕榈酸后,荧光强度有所下降。5种环糊精中与棕榈酸结合效果最强的是β-CD,其次是γ-CD和α-CD。鉴于β-CD有较高的溶血风险,本课题选择较为安全稳定的γ-CD进行下一步研究。2环糊精包合棕榈酸作用检测2.1 热失重分析法(Thermogravimetric analysis,TGA)通过冷冻干燥法制备了棕榈酸与γ-CD 1:1包合物及1:10包合物,并按摩尔比制备1:1物理混合物。将它们分别在室温至300℃的范围内进行TGA检测。通过热重曲线可见,不同比例的包合物未出现明显的热失重速率(DTG)峰值,呈现出不同于其余各样本的热重曲线特征,表现出新物质的热力学特性。2.2 差示扫描量热法(Differential scanning calorimetry,DSC)按TGA方法制备相同样品后在室温至300℃的范围内进行DSC检测。各组DSC曲线信息表明,1:1包合物组出现的两个放热峰特征明显不同于棕榈酸组与γ-CD组,说明新物质的生成,而1:10包合物组于88.25℃出现的大宽峰与y-CD的放热峰特征相似。在棕榈酸与γ-CD 1:1物理混合物的DSC曲线图中,可明显看出棕榈酸和γ-CD的峰型特征,说明单纯物理混合并未改变二者的物理性质。2.3 扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)观察使用SEM对各组样品进行扫描,分别在200×、2000×倍镜下拍照。观察发现,在200×倍镜下,各组形貌特征差异显著。在2000×倍镜下,棕榈酸样品呈现不规则岩块状,而γ-CD则表现出表面光滑、边缘锋利的晶体状结构。1:1物理混合物的特征与棕榈酸组相似。1:1包合物组样品呈现明显的鳞片状,能看到孔状空腔,其结构特征较其他各组明显不同,因此说明,棕榈酸与环糊精包合后新物质的产生。以上实验说明,γ-CD与棕榈酸可进行结合,形成新包合物。3 y-CD对棕榈酸引起的肝细胞脂性凋亡的影响3.1 y-CD与棕榈酸分别及包合后对肝细胞活性的影响通过CCK-8实验考察了 γ-CD在24h和48h对HepG2细胞活性的影响。结果显示应用6.25mmol/L的γ-CD干预细胞48h,细胞仍保持80%以上活性。仍采用CCK-8实验对棕榈酸的毒性作用浓度进行探究,结果表明以400μmol/L的棕榈酸干预细胞24h可使细胞活性显著降低。以γ-CD包合棕榈酸后作用于HepG2细胞,高剂量组可显著提高HepG2细胞活性(P<0.01)。以上实验说明,γ-CD包合棕榈酸后能显著抑制后者引起的肝细胞活性下降。3.2 γ-CD与棕榈酸分别及包合后对肝细胞凋亡的影响应用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测胞内 Bcl-2 相关 X 蛋白(Bcl-2-Associated X,Bax)和 B 细胞淋巴瘤蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表达情况,结果显示棕榈酸组与对照组相比,促凋亡蛋白Bax含量显著升高(P<0.01);Bax含量在γ-CD低中高剂量组均明显下降(P<0.05)。而对各组抗凋亡蛋白Bcl-2含量检测显示各组间无显著变化(P>0.05)。采用免疫组化法检测各组细胞内天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cysteinyl aspartate sselleck INCB28060pecific proteinase-3,Caspase-3)的表达情况。棕榈酸组中红色荧光显著强于其他各组,而应用γ-CD包合棕榈酸后,中高剂量组的荧光强度显著低于棕榈酸组。4 γ-CD对棕榈酸引起肝细胞脂质堆积和氧化应激影响4.1 γ-CD对棕榈酸引起肝细胞脂质堆积的影响采用油红O染色法观察细胞内脂滴,脂滴的形成可直观反应脂质堆积。用400μmol/L棕榈酸干预HepG2细胞48h后进行染色处理,棕榈酸组可见明显的红棕色圆形脂滴,表明脂质沉积的形成。用γ-CD包合棕榈酸后,各组呈现脂滴含量减少。为进一步准确对胞内脂质定量分析,检测细胞内总胆固醇(Total cholesterol,TC)和甘油三脂(Triacylglycerol,TG)含量,发现棕榈酸组的TC含量较对照组有明显升高(P<0.05),应用γ-CD包合棕榈酸后,各组TC含量均有降低,但无显著性差异(P>0.05)。TG含量检测显示,棕榈酸组较对照组TG含量显著升高(P<0.01),γ-CD各剂量组较棕榈酸组均有显著性降低(P<0.05),在中高剂量组差异更显著(P<0.01)implantable medical devices。4.2 γ-CD对棕榈酸引起肝细胞氧化应激和炎症因子释放的影响应用硫代巴比妥酸法检测细胞内丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,结果显示棕榈酸组MDA含量显著增加(P<0.01),加入γ-CD后在中高剂量组MDA含量显著下降(P<0.01)。用荧光探针DCFH-DA检测活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量,结果显示相较于对照组,棕榈酸组ROS含量显著升高(p<0.05),应用y-CD后的低中剂量组未表现出显著性差异(P>0.05),在高剂量组中ROS显著降低(P<0.05)。应用黄嘌呤氧化法检测细胞内超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性。结果表明,棕榈酸组SOD酶活力显著降低(P<0.01),在各给药组中SOD酶活力呈升高趋势,仅在高剂量组表现出显著性差异(P<0.05)。ELISA检测细胞上清中肿瘤坏死因子(Tumour necrosis factor-α,TNF-α)的含量。结果显示棕榈酸组中炎症因子TNF-α的含量明显升高(P<0.05),加入γ-CD的各组中TNF-α含量下降,相较于棕榈酸组,中高剂量组出现显著差异(P<0.05)。4.3 γ-CD对棕榈酸引起内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)的影响免疫荧光法标记胞内蛋白激酶R样内质网激酶(Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)和激活转录因子 4(Activating Transcription Factor 4,ATF4)表达。结果显示,与对照组相比,棕榈酸组PERK和ATF4表达增强,加入不同剂量γ-CD组中则这个两个反映ERS的指标明显减弱。这部分结果表明,棕榈酸干预HepG2细胞可产生显著脂质沉积,并产生脂毒性,包括引起细胞内氧化还原系统失衡,炎症因子TNF-α的释放以及ERS;应用γ-CD包合棕榈酸,上述各指标均有改善,表明γ-CD包合棕榈酸可减轻棕榈酸导致的系列氧化应激和炎症反应。5 γ-CD对棕榈酸引起的肝细胞膜流动性及葡萄糖代谢影响5.1 γ-CD包合棕榈酸对肝细胞膜脂肪酸交换和摄取的影响首先用激光共聚显微镜对γ-CD与FITC-棕榈酸共同作用于细胞的效果拍照,然后用Image J处理分析。在对照组中无明显荧光,棕榈酸组荧光较强,中高剂量γ-CD组呈现平均荧光强度显著下降(P<0.05)。Compound 3 IC50表明γ-CD阻止了细胞对棕榈酸的摄取。5.2肝细胞膜流动性检测应用光漂白荧光恢复技术(Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)检测细胞膜的流动性,用荧光恢复率(M)表示膜流动性。数据处理分析后可见棕榈酸明显使膜流动性降低(P<0.01),应用γ-CD包合棕榈酸后,膜流动性有一定改善,在中高剂量组与棕榈酸组相比出现显著差异(P<0.05、P<0.01)。5.3 γ-CD包合棕榈酸对肝细胞糖代谢的影响5.3.1肝细胞糖摄取检测和细胞培养基内葡萄糖消耗检测2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose,2-NBDG)是一种荧光葡萄糖类似物,采用流式分析仪检测细胞对2-NBDG的摄取情况。在未添加胰岛素的实验中,棕榈酸组对2-NBDG的摄取较对照组出现显著降低(P<0.05),中剂量γ-CD明显改善此种情况(P<0.05),高剂量组呈现摄取量升高。在添加胰岛素的各实验组中,整体2-NBDG摄取量与未添加胰岛素的实验组相比有所增加,表明胰岛素促进了细胞对糖的利用。棕榈酸组与对照组相比糖摄取量显著降低(P<0.01),应用γ-CD包合棕榈酸后的各组中细胞对2-NBDG的摄取显著升高(P<0.05、P<0.01)。葡萄糖消耗实验发现,棕榈酸组的糖消耗量较正常细胞显著减少(P<0.01),低中剂量组γ-CD较棕榈酸组未出现明显升高(P>0.05),在高剂量组升高明显(P<0.01)。这两个结果均表明,棕榈酸作用于肝细胞可以抑制肝细胞对葡萄糖的摄取。5.3.2肝细胞ATP含量检测萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)法检测胞内ATP。棕榈酸组胞内ATP显著低于对照组(P<0.05)。应用γ-CD的各剂量组中呈升高趋势,中高剂量组较棕榈酸组差异显著(P<0.05)。这部分结果显示,棕榈酸作用于肝细胞会降低细胞膜的流动性,使与膜相关的糖摄取利用受到阻碍,进而使肝细胞处于低能量代谢状态。应用γ-CD包合棕榈酸后,不仅在一定程度上改善了膜流动性,也使肝细胞对糖摄取利用增加,恢复肝细胞的正常能量代谢。6结论本课题确证γ-CD可包合棕榈酸,并利用此作用发挥减弱或阻断棕榈酸所引起的肝细胞脂毒性,包括脂性凋亡、氧化应激、内质网应激、细胞膜流动性下降和伴随的糖代谢障碍,显示γ-CD具有开发为靶向游离脂肪酸的降脂新药潜力。